聯合TCGA和GEO數據庫構建和分析胃癌中circRNA相關的ceRNA網絡

李 讓,廖苑君,孫勝南,藍樹金,趙小蕾,覃繼恒,饒紹奇*

(廣東醫科大學a．公共衛生學院;b．醫學系統生物學研究所,中國廣東東莞523808)

作為嚴重危害人類健康的消化道惡性腫瘤之一,胃癌的發病率和死亡率在惡性腫瘤中分別處于第5位和第3位[1]。各種治療手段的應用使得胃癌患者的5年生存率有所上升,但胃癌晚期患者的預后仍然較差。目前,胃癌仍是威脅人類健康的復雜疾病,其發生、發展機制尚未完全明確。

競爭性內源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)的概念由哈佛大學醫學院Poliseno等[2]首先提出,其并非一種全新的RNA,而是代表了一種新的基因表達調控模式。既往研究表明,微RNA(microRNA,miRNA)通過與靶mRNA的3′非翻譯區(3′-untranslated region,3′-UTR)結合抑制靶mRNA的翻譯,實現在轉錄后水平調節基因的表達,從而調控腫瘤細胞的生長、發育[3]。在ce-RNA的理論假說中,任何擁有miRNA反應元件(miRNA response element,MRE)結構的RNA都可以作為ceRNA,包括環狀RNA(circular RNA,circRNA)、長鏈非編碼 RNA(long noncoding RNA,lncRNA)、mRNA和假基因轉錄物等。作為ceRNA家族的一員,circRNA同樣能夠通過競爭性地結合miRNA來調控基因的表達[4]。circRNA因5′和3′端通過共價鍵相連而呈封閉環狀結構[5],相對于線性RNA,特殊的結構使得circRNA擁有更強的穩定性和更高的保守性[6]。隨著高通量測序技術的發展,大量潛在的circRNA被發現,并且被證實作為腫瘤的重要調節因子與癌癥的發生密切相關[7～9]。近年來,越來越多的研究表明circRNA在胃癌的發生、發展中起著重要作用[10～11]。此外,circ-RNA具有的分布范圍廣、保守性高、組織表達特異性高等特點,也預示著其有望成為胃癌診斷的生物標志物或胃癌治療的靶點[12～13]。

基于生物信息學分析和多數據庫的聯合應用,本研究挖掘了胃癌中差異表達的circRNA、miRNA和mRNA并構建了ceRNA網絡;隨后,利用網絡的拓撲屬性分析手段,鑒定了核心的circ-RNA并提取了circRNA介導的ceRNA子網;最后,以ceRNA機制為切入點研究了核心circRNA在胃癌發生發展中的作用機制,這為胃癌的診斷與治療提供了潛在靶點,同時也為研究circRNA在胃癌中的作用機制提供了新的思路。

1 材料和方法

1.1 數據來源

從GEO(Gene Expression Omnibus)數據庫[14]中按照以下標準獲取胃癌的circRNA基因芯片數據:以“gastric cancer”&“circRNA”為關鍵詞檢索與胃癌相關的circRNA基因芯片;選擇物種為“Homo sapiens”、研究類型為“expression profiling by array”兩個過濾條件進一步篩選數據;最后選定實驗設計符合病例對照研究類型并且病例與對照的組織樣本數均大于或等于3的芯片。根據篩選結果,我們下載了兩套胃癌的circRNA基因芯片:GSE13-1414(包含3個胃癌組織和3個非癌組織)和GSE100170(包含5個胃癌組織和5個非癌組織)。

作為目前最權威的癌癥基因信息數據庫,TCGA(The Cancer Genome Atlas)數據庫[15]覆蓋 33 種癌癥類型,含有超過30 000例的腫瘤樣本以及20 000個基因的表達信息。本研究利用gdc-client工具從TCGA數據庫下載了胃癌的RNA-seq和miRNA-seq數據,其中RNA-seq數據包括30個正常樣本和343個腫瘤樣本,miRNA-seq數據包括45個正常樣本、446個腫瘤樣本及406個病人的生存數據。

1.2 差異表達RNA的篩選

利用 R 語言(版本 3．5．0)和 Bioconductor平臺中的limma包對芯片數據進行差異分析[16],篩選差異表達的circRNA(DE-circRNA),納入標準為:P value＜0．05,|log2fold change(log2FC)|＞1。取 GSE1-31414和GSE100170芯片中差異表達的circRNA的交集作為最終篩選出來的DE-circRNA。

對于從TCGA數據庫下載的RNA-seq和miRNA-seq數據,首先去除平均表達值低于1的mRNA和miRNA,隨后利用edgeR包進行差異分析[17],最后通過錯誤發現率(false discovery rate,FDR)校正,以 FDR＜0．05 同時|log2FC|＞1 為標準篩選出差異表達的miRNA(DE-miRNA)和mRNA(DE-mRNA)。

1.3 ceRNA網絡的構建

首先,采用CircInteractome數據庫預測DE-circRNA和DE-miRNA的調控關系[18],構建circ-RNA-miRNA關系對。隨后,利用miRDB、miRTarBase和TargetScan數據庫預測DE-miRNA和DE-mRNA的調控關系[19],將同時在任意兩個或兩個以上數據庫都被預測到的miRNA-mRNA調控關系納入后續的分析中。最后,基于共享的miRNA構建circRNA-miRNA-mRNA ceRNA調控網絡,并利用 Cytoscape 軟件(版本 3．6．1)對調控網絡進行可視化[20]。

1.4 關鍵網絡的提取

研究表明網絡中的核心節點(拓撲屬性前10%～20%)在疾病網絡中扮演者關鍵角色[21～22],而這些核心節點一旦受到破壞,將會影響網絡的功能,進而影響疾病的發生發展[22]。本研究利用Cytoscape軟件的NetworkAnalyzer工具對構建的ceRNA網絡進行拓撲屬性分析[23],合并度數(degree)、中介中心性(betweenness centrality)、輻射力(radiality)3種指標,取網絡中處于前10%的節點作為核心節點,并根據這些核心節點從原始的ceRNA網絡中提取子網。

1.5 功能富集分析和生存分析

通過在線網站KOBAS對子網進行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析[24],分析子網行使的生物學功能。整合來自TCGA數據庫中胃癌的RNA表達數據和生存數據,使用R語言的survival包對子網進行生存分析,以挖掘預后相關的基因。

本研究遵循上述流程開展,技術路線見圖1。

2 結果

2.1 差異表達的RNA

圖1 數據獲取及分析流程圖Fig.1 The flow chart of data acquisition and analysis

芯片數據的差異表達分析結果顯示,在GSE131414與GSE100170芯片中分別獲得了1 522個和713個差異表達的circRNA,兩者取交集后得到45個circRNA(圖2A～C)。對于RNA-seq數據和miRNA-seq數據,差異分析后分別獲得了4 610個差異表達的mRNA和276個差異表達的miRNA(圖 2D,E)。．

2.2 原始ceRNA網絡的構建

通過數據庫的預測構建了1 538對circ-RNA-miRNA和2 029個miRNA-mRNA關系對。隨后,基于共享miRNA構建了一個包含153對circRNA-miRNA和2 029個miRNA-mRNA關系對的ceRNA調控網絡(圖3),其中包含39個circ-RNA、30個miRNA和1 303個mRNA。

2.3 circRNA介導的ceRNA子網絡

對原始ceRNA網絡的拓撲屬性進行分析后發現,3個 circRNA節點(hsa_circ_0008468、hsa_circ_0005822、hsa_circ_0025842)和 3 個 mi-RNA 節點(hsa-miR-940、hsa-miR-944、hsa-miR-515-5p)在3種拓撲學指標排名中都處于前10%,提示它們為網絡的核心節點。根據3種指標對節點進行排序,前10個核心節點的拓撲參數見表1。基于鑒定到的6個核心節點,我們從原始的ceRNA網絡中提取了子網絡,其中包括3個circ-RNA、3個 miRNA和 501個 mRNA,共有 8對circRNA-miRNA和539個miRNA-mRNA關系對(圖 4)。

2.4 子網的功能富集分析

KEGG通路富集分析結果顯示,子網富集于代謝途徑(hsa01100)、cAMP 信號通路(hsa04024)、神經活性配體-受體相互作用(hsa04080)、pathways in cancer(hsa05200)等多個有統計學意義的信號通路(圖 5)。

2.5 子網的生存分析

圖2 胃癌中差異表達的RNA(A)GSE100170芯片中差異表達的circRNA;(B)GSE131414芯片中差異表達的circRNA;(C)芯片中差異表達circRNA的韋恩圖;(D)TCGA數據庫中差異表達的mRNA;(E)TCGA數據庫中差異表達的miRNA。紅色和綠色的點分別代表上調和下調的RNA;黑色的點代表變化不顯著或變化倍數小的RNA。Fig.2 The differentially expressed RNAs in gastric cancer(A)Differentially expressed circRNAs in the GSE100170 chip;(B)Differentially expressed circRNAs in the GSE131414 chip;(C)Venn diagram of differentially expressed circRNAs;(D)Differentially expressed mRNAs in the TCGA database;(E)Differentially expressed miRNAs in the TCGA database．The red and green dots represent up-and down-regulated RNAs,respectively,and black dots represent the RNAs that do not reach the threshold for screening differentially expressed RNAs．

圖3 胃癌中circRNA介導的ceRNA網絡三角形、倒三角和圓形分別代表差異表達的circRNA、miRNA和mRNA;紅色代表上調,綠色代表下調。Fig.3 The circRNA-mediated ceRNA network in gastric cancerTriangles,inverted triangles and circles represent DE-circRNA,DE-miRNA and DE-mRNA,respectively．The colors red and green represent up-regulation and down-regulation,respectively．

表1 原始ceRNA網絡中排名前10的circRNA和miRNA的拓撲屬性Table 1 Topological properties of the top 10 circRNAs and miRNAs in the primary ceRNA network

生存分析發現子網中有14個基因與胃癌的預后顯著相關(P＜0．01)。其中,ACO2、E2F8 的高表達組相對于低表達組預后較好;而GHR、ITIH5、KLHDC8A、NPAS3、PDE2A、PDGFD、PNMA2、RAB9B、RECK、SLC24A2、TMEM55A、TMTC1 的高表達組相對于低表達組預后較差,結果見圖6。

3 討論

圖4 競爭性內源RNA子網三角形、倒三角和圓形分別代表差異表達的circRNA、miRNA和mRNA;紅色代表上調,綠色代表下調。Fig.4 The ceRNA subnetworkTriangles,inverted triangles and circles represent DE-circRNA,DE-miRNA and DE-mRNA,respectively．The colors red and green represent up-regulation and down-regulation,respectively．

圖5 KEGG功能富集圖Fig.5 The KEGG functional enrichment diagram

ceRNA概念的提出將傳統的相互作用模式由“miRNAs→mRNAs”網絡變成更加多元的“RNAs→miRNAs→mRNAs”復雜調控網絡[25]。在“miRNAs→mRNAs”互作網絡中,miRNA通過以單個miRNA調節多個不同mRNA或以多個不同的miRNA調節單個mRNA的方式作用于靶基因3′-UTR區域,實現對mRNA的降解或功能抑制。ceRNA概念的提出賦予了circRNA等非編碼RNA新的生物學功能[26],極大地豐富了轉錄調控網絡。ceRNA競爭性結合miRNA,降低miRNA對靶基因mRNA的抑制作用,多種ceRNA、miRNA與mRNA之間的相互作用形成復雜的ceRNA調控網絡[27],從而參與包括腫瘤發生發展在內的一系列生物學過程[28～29]。隨著對circRNA認識的不斷加深,circRNA被證實在腫瘤基因表達中扮演著不可或缺的調控作用[30],并且在腫瘤的發生發展中起著重要作用[31]。本研究通過GEO和TCGA數據庫的聯合應用構建了胃癌中由circRNA介導的原始ceRNA調控網絡,并進一步通過網絡分析挖掘了緊密聯系的核心節點,提取了關鍵子網。最后,對關鍵子網進行了功能富集分析,以判斷網絡行使的生物學功能;同時,通過生存分析挖掘了與胃癌預后相關的基因。

圖6 ceRNA子網中14個預后基因的生存曲線Fig.6 The survival curves of 14 prognostic genes in ceRNA subnetwork

相關研究發現,miRNA通過調控靶基因表達參與細胞增殖、凋亡和侵襲等多種生物學行為[26]。利用網絡拓撲屬性分析,本研究挖掘了3個核心miRNA,分別為 hsa-miR-940、hsa-miR-944、hsamiR-515-5p。通過文獻搜索發現,這3個核心節點已被報道與胃癌密切相關,例如:Fan等[32]研究表明,hsa-miR-940通過hsa-miR-940/Cbl-b/STAT5a軸上調PD-L1(programmed death ligand-1)的表達,從而促進胃癌細胞的增殖和遷移;Pan等[33]研究證實,hsa-miR-944通過與MACC1(metastasis-associated in colon cancer 1)的 3′-UTR 序列結合下調MACC1在胃癌細胞中的表達,從而抑制上皮-間質轉化和胃癌的轉移;Wang等[34]報道,hsa-miR-515-5p表達水平的上升抑制了胃癌的發生,并與胃癌細胞的生長和侵襲密切相關。文獻檢索的結果不僅證實了從原始ceRNA網絡中鑒定的3個核心miRNA在胃癌發生發展中扮演著重要角色,同時也印證了本文分析方法在網絡核心節點的識別方面擁有較高的準確性。

通過對ceRNA子網進行KEGG信號通路的富集分析,我們發現子網顯著富集到代謝途徑(hsa01100)、cAMP 信號通路(hsa04024)、神經活性配體-受體相互作用(hsa04080)、pathways in cancer(hsa05200)等多個有統計學意義的信號通路(圖5)。其中,大部分通路已有文獻支持與腫瘤發生機制密切相關,如經典的PI3K-Akt信號通路,當其被酪氨酸激酶受體激活后,磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)催化磷脂酰肌醇4,5-雙磷酸磷酸化為磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸,導致3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide dependent protein kinase 1,PDK1)和蛋白激酶B(protein kinase B,PKB;也稱作Akt)募集到質膜并被激活,而后Akt作用于多個下游效應因子,影響腫瘤細胞的生長、增殖和凋亡[35]。另外,Yin等[36]研究表明,嘌呤核苷酸是腫瘤細胞增殖的基礎和必要條件,在腫瘤細胞中嘌呤合成途徑的酶代謝得到了增強,而且嘌呤代謝受損與癌癥的發展有關。Boroughs等[37]研究報道,癌細胞的生長和繁殖增加了其對營養物質的攝取,而各種代謝途徑可為癌細胞的生長和增殖提供必要的物質支持,其中代謝重編程被認為是癌癥的標志[38]。以上信息提示,hsa_circ_0008468、hsa_circ_000-5822和hsa_circ_0025842介導的ceRNA網絡參與了胃癌發生發展的多個生物學過程。

在生存分析中我們發現circRNA介導的子網中存在多個與胃癌預后相關的基因(圖6)。而3個核心的circRNA(hsa_circ_0008468、hsa_circ_000-5822、hsa_circ_0025842)可能通過 circRNA-mi-RNA-mRNA調控軸調節這些預后基因的表達,從而影響胃癌病人的預后。例如:在hsa_circ_002-5842-hsa-miR-940-ACO2調控軸中,hsa_circ_002-5842 下調、hsa-miR-940 上調、ACO2 下調(圖 4)。hsa_circ_0025842的低表達會減弱其對hsa-miR-940的競爭性吸附,使得過量的hsa-miR-940與ACO2結合,從而使ACO2表達水平降低。本研究的生存分析結果(圖6)以及相關研究[39]都表明,ACO2低表達的胃癌患者相對于ACO2高表達的患者擁有較低的生存率。因此,我們推測hsa_circ_0025842的低表達可能與胃癌病人的不良預后相關。又如:在hsa_circ_0005822-hsa-miR-944-SLC24A2調控軸中,hsa_circ_0005822上調、hsamiR-944下調、SLC24A2上調(圖4)。這說明hsa_circ_0005822的上調可促進SLC24A2的表達,而本文的生存分析結果顯示SLC24A2高表達的胃癌患者擁有較低生存率(圖6),提示hsa_circ_000-5822的高表達與胃癌患者不良預后相關。另外,在hsa_circ_0008468-hsa-miR-940-PDE2A調控軸中,hsa_circ_0008468下調、hsa-miR-940上調、PDE2A下調(圖4),提示hsa_circ_0008468的下調抑制了PDE2A的表達。相關研究發現PDE2A的低表達會抑制腫瘤細胞的生長與侵襲[40],同時本研究的生存分析表明PDE2A低表達的胃癌患者擁有更佳的預后。因此,我們推測hsa_circ_0008468的低表達可改善胃癌患者的預后。綜上所述,在ceRNA網絡中,3個核心的circRNA可能通過競爭性地結合miRNA實現對預后基因的調控,從而影響胃癌患者的預后。

總的來講,本研究通過生物信息學的方法挖掘了原始ceRNA網絡中核心的circRNA,并提取了核心circRNA介導的ceRNA子網,為circRNA的ceRNA機制研究提供了參考方向,同時也為胃癌的診斷、治療提供了新的分子靶點。研究過程采用的方法具有普適性和創新性,為后續深入的實驗性研究提供了基礎。