不同掃描電鏡制樣方法觀察棉花葉片氣孔

劉 愷,密玲煜,劉玲玲,李 洋*

(1．河南大學植物逆境生物學重點實驗室/棉花生物學重點實驗室,中國河南開封475004;2．開封市求實高中,中國河南開封475004)

棉花是最主要的經濟作物之一,與國民生活密切聯系,影響著經濟的發展,是我國很重要的一種戰略儲備[1]。棉花的主要產地大部分位于干旱和半干旱地區,而干旱特別是棉花蕾期的干旱影響著棉花的單株產量和纖維長度[2],是制約棉花生產的重要因素[3]。使用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察氣孔形態,是研究棉花抗旱機理的重要手段[4]。

SEM的成像原理是細聚焦電子術轟擊待測樣品,入射電子與樣品弱束縛價電子產生非彈性散射電子(也稱為二次電子,二次電子的產生額與電子術和樣品的入射角正相關),通過電子術在樣品表面小片區域內逐點掃描,并逐點收集產生的二次電子信號,便可放大并還原出樣品的表面形貌[5]。因為電子術的穿透能力很差,所以SEM的腔室在測試期間需要保持真空狀態。為了避免樣品在真空環境下失水而發生形變,鏡檢樣品必須保持干燥[6]。電子術轟擊樣品后,如果無法及時導出就會聚集在樣品表面,聚集的電子同樣形成二次電子信號,造成鏡檢的局部高亮,影響樣品形貌的觀察,這種現象叫做荷電。荷電現象要求鏡檢樣品必須導電。大部分生物材料在使用常規的SEM進行鏡檢觀察時,都需要一系列繁瑣的制樣步驟來使其滿足這兩個條件。而繁瑣的制樣過程不可避免地會破壞樣品表面的細節[7],因此人們希望可以通過更新SEM技術簡化觀察含水樣品的步驟,以探求生物樣品最真實的形貌。隨著科技的發展,環境掃描電子顯微鏡(environmental scanning electron microscope,ESEM)[8]和冷凍掃描電子顯微鏡(cryo-SEM)先后產生。ESEM借助多級壓差光闌技術,在確保電子槍室處于高真空的同時,以水蒸氣或者氮氣為媒介,使樣品室處于相對低的真空,通過半導體降溫的方式,降低樣品臺溫度,減緩含水樣品的水分散失[9];同時,利用氣體二次電子探頭技術,減少氣體二次電子對樣品二次電子的干擾,并減弱樣品荷電的產生,使得含水樣品得以直接觀察[10]。Cryo-SEM借助固態氮氣超低溫(-196℃)冷凍技術,使得樣品中的水形成玻璃態的冰,以減少液體冷凍聚集,從而不影響樣品表面形貌[11];同時,利用冷凍傳輸技術,使樣品從超低溫冷凍制樣到電鏡觀察一直保持低溫狀態,避免其在高真空下失水,從而做到對含水樣品在冷凍狀態下的快速電鏡觀察[12]。此外,本實驗室借鑒光學顯微鏡涂撕法觀察植物表皮的方法[13],開發了將指甲油涂抹在樣品表面,撕取表面所形成的指甲油膜進行SEM觀察的方法(print-SEM),其用印染的相代替含水樣品來觀察樣品表面形貌[14]。

本文分別采用上述4種不同方法,對棉花葉片的氣孔進行SEM觀察,以探究這4種方法在棉花氣孔研究方面的優缺點,從而為棉花抗旱相關的基礎和應用研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所使用的棉花葉片取自陸地棉(Gossypium hirsutum)野生型植株,葉齡為25 d。實驗材料種植于溫室中,由棉花生物學國家重點實驗室(河南大學)提供。

1.2 儀器和試劑

本研究所使用的掃描電子顯微鏡型號為QUANTA 250(FEI公司,美國),該電鏡為環境掃描電子顯微鏡,能進行高真空掃描、低真空掃描和環境掃描3種模式的電鏡觀察。另外,該電鏡加裝有型號為Alto 1000的冷凍傳輸裝置(GATAN公司,美國),可以進行冷凍掃描電鏡觀察。其他主要儀器設備有型號為MSP-2S的真空離子濺射儀(IXRF公司,日本)和型號為K850的CO2臨界點干燥儀(EMITECH公司,英國)。

實驗中使用的試劑主要包括:25%戊二醛(電子顯微鏡級,SPI公司,美國);一水磷酸二氫鈉(NaH2PO4·H2O,分析純級,上海生工生物工程股份有限公司);十二水磷酸氫二鈉 (Na2HPO4·12H2O,分析純級,上海生工生物工程股份有限公司);無水乙醇(分析純級,國藥集團化學試劑有限公司);冷凍包埋劑(櫻花公司,美國)。

1.3 常規掃描電鏡制樣方法及觀察

裁取2 mm×2 mm的棉花葉片組織塊,放入4℃預冷的戊二醛固定液(體積分數 2．5%,由0．1 mol/L pH 7．1的磷酸緩沖液配制),抽真空約1 h,直至葉片沉入固定液中。4℃固定12 h以上,最長不可超過 4 d。磷酸緩沖液(0．1 mol/L,pH 7．1)清洗2次,每次 15 min;30%、40%、50%、70%、90%、100%、100%乙醇各15 min梯度脫水。脫水樣品經CO2臨界點干燥后用真空離子濺射儀噴鍍15 s,最后在電鏡高真空模式下選擇電壓25 kV spot 3觀察成像(圖 1A)。

1.4 環境掃描電鏡制樣和觀察

裁取5 mm×5 mm的棉花葉片組織塊,放入ESEM中,在電鏡樣品室壓強500 Pa、環境真空模式下選擇電壓25 kV spot 4觀察成像(圖1B)。

1.5 冷凍掃描電鏡制樣和觀察

裁取2 mm×2 mm的棉花葉片組織塊,用少量冷凍包埋劑將其固定于樣品桿上,經液氮泥速凍后用電鏡檢測樣品表面的冰晶量,并于95℃升華除冰5 min,然后再用電鏡檢測樣品表面的冰晶量,如果表面仍有冰晶,再次升華除冰,直至消除樣品表面所有冰晶。除冰后的樣品先用真空離子濺射儀噴鍍90 s,隨后在電鏡高真空模式下選擇電壓5 kV spot 4觀察成像(圖1C)。

1.6 涂撕法掃描電鏡制樣和觀察

取棉花葉片,將指甲油均勻涂抹在要觀察區域的表面(不要反復涂抹以免損傷表面特征),5 min自然干燥后撕取指甲油印模,并裁取5 mm×5 mm的樣品塊。采用真空離子濺射儀噴鍍15 s后,在電鏡高真空模式下選擇電壓25 kV spot 3觀察成像(圖 1D)。

1.7 數據處理

氣孔開度數據通過ImageJ軟件測量獲得,以平均值±標準差(±s)表示。組間比較采用單因素方差分析;顯著性水平為P＜0．05具有統計學意義。柱狀圖通過Origin 8．0軟件繪制。

2 結果

2.1 實驗取材對比

固定步驟的固定速率也稱作固定溶液滲透速率,其限制著生物材料樣品制備的大小。由于常規SEM制樣和cryo-SEM制樣都有固定這一步驟,不同的是前者采用的是戊二醛化學固定法,后者采用的是液氮泥冷凍法,所以我們在這兩種制樣方法中的取材大小均選擇了2 mm×2 mm。在采用ESEM觀察生物樣品期間,樣品仍會緩慢失水,所以樣品的取材應盡可能大,以減緩樣品中心區域的失水速度,提高對樣品中心區域觀察的效果,因此本實驗針對該方法選擇了5 mm×5 mm的樣品尺寸。而print-SEM由于不涉及到固定和失水,所以也同樣選擇了5 mm×5 mm的樣品尺寸,以獲得更大的觀察范圍。從取樣難度比較,print-SEM實驗最難,cryo-SEM實驗較難,常規SEM制樣實驗較簡單,ESEM實驗最簡單。實驗取材過程的具體對比情況如表1所示。

圖1 制樣方法的簡易流程(A)常規掃描電鏡制樣觀察棉花葉片;(B)環境掃描電鏡觀察棉花葉片;(C)冷凍掃描電鏡觀察棉花葉片;(D)涂撕法掃描電鏡觀察棉花葉片。Fig.1 Simple process of sample preparation methods(A)Regular SEM sample observation of cotton leaves;(B)ESEM observation of cotton leaves;(C)Cryo-SEM observation of cotton leaves;(D)SEM with a tearing sample preparation in observation of cotton leaves．

2.2 實驗周期及實驗繁瑣程度對比

采用常規的SEM觀察生物樣品時其實驗步驟包括:取材、固定、脫水、干燥、噴鍍、電鏡觀察,為了使樣品獲得更好的固定效果,一般選擇過夜(12 h)固定。在本研究中我們選擇30%、40%、50%、70%、90%、100%、100%乙醇對樣品進行梯度脫水處理,每步15 min;樣品干燥采取的是CO2臨界點干燥,干燥過程耗時2 h。總的來講,常規SEM制樣整體耗時約18 h(圖1A)。采用ESEM觀察樣品時可直接將新鮮樣品使用雙面碳膜膠帶粘于樣品臺,整個樣品處理過程耗時約15 min(圖1B)。采用cryo-SEM觀察生物樣品時其實驗步驟包括:冷凍固定、鏡檢冰晶厚度和熱升華冰晶(重復這兩個步驟,直至樣品表面不再覆蓋冰晶)、噴鍍、電鏡觀察。在該方法中,樣品需要多次往返轉移電鏡樣品室與冷凍傳輸裝置,實驗耗時較長,約2 h。此外,cryo-SEM在樣品觀察前需要1．5 h的時間進行電鏡設備預冷,觀察完成后需要5 h的時間使得電鏡設備恢復至室溫(圖1C)。對于print-SEM實驗,其影印、噴鍍和電鏡觀察的總耗時約25 min(圖1D)。通過對各方法的實驗周期進行對比可知,常規SEM實驗制樣耗時最長,cryo-SEM實驗耗時較長,print-SEM實驗耗時較短,ESEM實驗耗時最短。從實驗繁瑣程度方面來講,cryo-SEM實驗最繁瑣,常規SEM制樣實驗相對繁瑣,print-SEM實驗相對簡單,ESEM實驗最簡單。實驗周期及實驗繁瑣程度的對比情況見表1。

2.3 鏡檢效果對比

從圖2可知,對于常規SEM制樣實驗獲得的棉花葉片樣品,通過2 000倍放大倍數觀察時,可以清楚地觀察到葉片表面的每一個細胞(圖2A);通過8 000倍的放大,將視野聚焦到單個氣孔時,也可以清晰地觀察到氣孔的表面結構(圖2B),這表現出了很高的分辨率和襯度。當然,鏡檢過程中也可以觀察到氣孔不夠飽滿,表皮細胞間不連續,存在溝壑(圖2),這主要是由于制樣過程存在一定程度的失水。

ESEM可以直接觀察裁取的棉花葉片樣品,通過2 000倍的放大,我們同樣可以清楚地觀察到葉片表面的每一個細胞,但是細胞呈現嚴重的褶皺(圖3A);通過8 000倍的放大,將視野聚焦到單個氣孔時,我們也可以清晰地觀察到氣孔的表面結構(圖3B)。總的來講,ESEM實驗也存在氣孔不夠飽滿,表皮細胞不連續,出現溝壑的情況,但是與常規SEM生物制樣實驗相比分辨率與襯度較低,導電效果不均一(圖3)。

表1 制樣過程比較Table 1 Comparison of sample preparation process

圖2 常規掃描電鏡制樣實驗觀察到的棉花葉片表面Fig.2 The surface of cotton leaves observed by SEM

采用cryo-SEM觀察棉花葉片樣品時,根據cryo-SEM的工作原理,高電壓觀察時會產生強烈的荷電,故選擇了5 kV的低電壓進行觀察,在該電壓下,鎢燈絲掃描電鏡無法做到高放大倍數觀察,并且與其他方法相比,在同等放大倍數下明顯表現出分辨率與襯度的下降,為了保證圖片效果,故相應減小了放大倍數。圖4結果顯示,通過500倍的放大,可以清楚地觀察到大視野的葉片表面,細胞紋理清晰自然(圖4A);通過2 000倍的放大,將視野聚焦到單個氣孔時,可以較清晰地觀察到氣孔的表面結構,氣孔和表皮細胞飽滿且連續,存在荷電現象(圖4B)。

在print-SEM實驗中,通過2 000倍的放大,可以清楚地觀察到葉片表面每一個細胞的鏡像(圖5A);通過8 000倍的放大,將視野聚焦到單個氣孔時,也可以清晰地觀察到氣孔鏡像的表面結構(圖5B),氣孔保衛細胞飽滿,表皮細胞紋理清晰且連續,表現出了很高的分辨率與襯度,但是細胞間隙出現明顯的尖端放電現象。進一步通過ImageJ圖片處理軟件,將所得到的圖片反向重構,得到清晰連續的表皮細胞顯微圖片(圖5C),在8 000倍視野下可以看到,樣品表面存在一定的龜裂(圖 5D)。

圖3 環境掃描電子顯微鏡實驗觀察到的棉花葉片表面Fig.3 The surface of cotton leaves observed by ESEM

圖4 冷凍掃描電子顯微鏡實驗觀察到的棉花葉片表面Fig.4 The surface of cotton leaves observed by cryo-SEM

圖5 涂撕法掃描電鏡制樣實驗觀察到的棉花葉片表面Fig.5 The surface of cotton leaves observed by print-SEM

根據上述4種不同制樣方法的鏡檢圖片,表2整理了它們在放大倍數、圖像分辨率、細胞狀態和荷電現象方面的差異。

2.4 細胞形態的分析比較

通過對比4種方法所得到的棉花氣孔掃描電鏡圖片,我們發現常規SEM制樣實驗和ESEM實驗所得到的氣孔均呈現張開狀態,而cryo-SEM實驗和print-SEM實驗所得到的氣孔均處于關閉狀態(圖6A)。氣孔長寬比是反應氣孔開閉狀態的重要參數,通過ImageJ軟件測量了4種實驗方法所拍得的各10組氣孔的長度和寬度,并進一步計算出了氣孔長寬比。統計學分析顯示cryo-SEM實驗、print-SEM實驗和ESEM實驗所拍得的氣孔的長寬比,極顯著高于常規SEM制樣實驗所拍得的氣孔的長寬比(圖6B),這與電鏡圖片相符。雖然ESEM實驗所拍得的氣孔有一定程度的張開,且長寬比平均值小于cryo-SEM實驗和print-SEM實驗所拍得的氣孔的長寬比,但是統計學分析顯示三者之間沒有明顯的差異(圖6B)。

進一步通過Photoshop軟件扣取4種實驗方法下棉花表皮細胞所呈現的主要形態,并繪制了這些形態的輪廓。對輪廓圖進行分析發現,cryo-SEM實驗和print-SEM實驗所得到的棉花表皮細胞呈現出修長、自然延伸狀態(圖7C,D),而常規SEM制樣實驗和ESEM實驗所得到的棉花表皮細胞呈現出短小、生長彎曲的狀態(圖7A,B)。分別將cryo-SEM實驗和print-SEM實驗所拍得的棉花表皮細胞,以及常規SEM制樣實驗和ESEM實驗所拍得的棉花表皮細胞的繪制輪廓進行疊加,發現兩者皆能較好地疊加在一起(圖7E,F)。

表2 鏡檢結果比較Table 2 Comparison of microscopy results

3 討論

本研究結果顯示:采用常規SEM生物制樣方法觀察棉花葉片表皮細胞時,過程最繁瑣,耗時最長(圖1)。鏡檢下樣品在很高的放大倍數下依然保持著較高的分辨率和襯度,但是由于化學固定法原理的局限性,鏡檢樣品表現出一定程度的失水(圖2);采用ESEM實驗觀察棉花葉片表皮細胞時,過程最簡單,耗時最短,可以觀察較大的樣品(圖1),但是鏡檢樣品同常規SEM生物制樣方法一樣,表現出了一定程度的失水,且同等放大倍數下其分辨率和襯度僅優于cryo-SEM實驗;采用cryo-SEM實驗觀察棉花葉片表皮細胞時,過程較繁瑣,耗時較長,操作難度最高(圖1,表1)。同時,與預期一致,cryo-SEM的鏡檢結果未表現出失水(圖4),但由于冷凍掃描技術的局限,冷凍掃描樣品的導電效果較差,故只能采用低電壓和低電子術斑(spot)來降低荷電現象。另外,同等放大倍數下,該方法的分辨率和襯度最低。場發射掃描電子顯微鏡具有低電壓模式,與其搭配的冷臺在高放大倍數下應該能達到更好的效果;采用print-SEM實驗觀察棉花葉片表皮細胞時,過程簡單,耗時較少(圖1),并且樣品未表現出失水,分辨率和襯度也較高,但是涂撕法樣品出現了明顯的尖端放電現象(圖5)。

圖6 不同電鏡制樣方法觀察到的棉花氣孔開度(A)棉花氣孔開度的掃描電鏡觀察結果。箭頭指示氣孔的開閉狀態,標尺:5 μm;(B)氣孔長寬比。**:與常規SEM觀察組相比 P＜0．01。Fig.6 The cotton stomatal aperture observed by different SEM methods(A)SEM observations of stomatal aperture．The arrow shows the opening or closing status of stomata and the scale bar indicates 5 μm;(B)The aspect ratio of stomata．**:P＜0．01,compared with SEM observation group．

圖7 不同方法觀察到的棉花表皮細胞的差異(A)常規掃描電鏡制樣觀察到的表皮細胞;(B)環境掃描電鏡觀察到的表皮細胞;(C)冷凍掃描電鏡實驗觀察到的表皮細胞;(D)涂撕法掃描電鏡實驗觀察到的表皮細胞;(E)常規掃描電鏡和環境掃描電鏡制樣方法所觀察到的表皮細胞的重疊;(F)冷凍掃描電鏡和涂撕法掃描電鏡制樣方法所觀察到的表皮細胞的重疊。Fig.7 Differences of cotton epidermal cells observed by different methods(A)Epidermal cells observed by SEM with conventional scanning electroscope sampling method;(B)Epidermal cells observed by ESEM;(C)Epidermal cells observed by cryo-SEM;(D)Epidermal cells observed by print-SEM;(E)The overlap of epidermal cells observed by normal SEM and ESEM;(F)The overlap of epidermal cells observed by cryo-SEM and print-SEM．

一般認為,采用cryo-SEM觀察樣品表面形態時,視野中所呈現出的顯微結構更接近于樣品本身形貌。在本實驗中,cryo-SEM實驗和print-SEM實驗無論是觀察到的棉花氣孔還是表皮細胞的形態,都表現出不同程度的一致性(圖6和圖7),說明這兩種實驗制樣方法所獲得的樣品因為水分喪失造成的形貌改變均較小。另外,常規SEM制樣實驗和ESEM實驗觀察到的棉花表皮細胞也表現出了較好的一致性,但在棉花氣孔形態方面存在明顯差異(圖6和圖7),這可能是由于氣孔保衛細胞里有豐富的細胞微管骨架,與表皮細胞相比,棉花氣孔的形態更難發生變化,所以在棉花葉片失水的條件下,先引起表皮細胞的形態變化,后引起氣孔保衛細胞形態的變化,故ESEM實驗所觀察到的棉花葉片表面形貌較常規SEM制樣實驗更接近于棉花樣品本身形貌。

綜上所述,本文采取的4種不同掃描電子顯微鏡制樣方法都可以用來觀察棉花葉片的氣孔。如果需要棉花氣孔密度類的統計數據,可以通過ESEM和print-SEM的方法進行實驗,它們將在最短的時間內得到大量的實驗數據;如果需要氣孔大小類的統計數據,可以通過cryo-SEM和print-SEM兩種方法來得到較為精確的實驗數據;如果需要棉花氣孔形貌的圖片數據,可以通過cryo-SEM的方法進行實驗,以得到最精準的實驗圖片數據;如果需要觀察保衛細胞表面形態的圖片數據,可以使用常規SEM生物制樣方法來得到高分辨率的圖片。