“邵氏五針法”對慢性哮喘大鼠GATA-3/T-bet表達的影響?

華金雙，邵素菊，鄭 潔，何竹青，楊京京，胡曉京，徐 寧，田 麗

(河南中醫藥大學針灸推拿學院，鄭州 450046)

支氣管哮喘是一種以氣道炎癥、氣道高反應性、可逆性氣道阻塞和氣道重塑為主要特征的慢性氣道疾病[1]。目前多數學者認為支氣管哮喘是一種免疫異常導致的變態反應性疾病，免疫功能紊亂在哮喘發病中起十分重要的作用，而輔助性T細胞在其中更是發揮著關鍵性作用[2]。Thl/Th2細胞失衡被認為是哮喘免疫學機制的發病基礎，尤其是向Th2細胞的偏移，因此糾正和阻止Thl/Th2細胞失衡是治療支氣管哮喘的關鍵和目標。Th2細胞表達轉錄因子GATA結合蛋白3(GATA-3)，促進B細胞增殖及IgE合成，介導體液免疫應答。Th2功能亢進時，促進嗜酸性粒細胞(EOS)、肥大細胞、淋巴細胞等炎癥細胞在效應部位趨化、募集并活化，釋放活性物質，引起氣道炎癥的蔓延。本實驗旨在探討以“邵氏五針法”為主的針灸方法對慢性哮喘大鼠免疫機制的影響，揭示針灸對哮喘大鼠Th1/Th2的上下游基因及細胞因子T-bet、GATA-3、白介素(IL)-5、γ干擾素(IFN-γ)的調控，從多角度、多層次闡明針灸治療慢性哮喘的分子生物學機制。

1 材料

1.1 動物及分組

SPF級健康雄性SD大鼠40只，體質量160 g～180 g，由河南省實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK(豫)2017-0001。將大鼠在SPF級實驗室飼養1周，飼養溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%，期間自由飲食。按隨機數字表法分為空白組、模型組、針刺組、艾灸組。本實驗已通過河南中醫藥大學第三附屬醫院實驗動物倫理委員會審查。

1.2 試劑及儀器

IL-5、IFN-γ大鼠血清Elisa試劑盒(貨號分別為CK-E30490R、CK-E30654R，蘇州卡爾文生物科技有限公司)；卵蛋白(OVA，美國Sigma公司)；氫氧化鋁干粉、生理鹽水、針灸針(0.30 mm×13 mm)；細艾條(0.7 cm×12 cm，湖香艾生物科技有限公司)；NE-C30型壓縮式霧化器(大連歐姆龍有限公司)；RM2015型切片機(德國Leica公司)；BX43型光學顯微鏡(日本OLYMpUS公司)；計算機圖像處理系統CMOS(日本OLYMPUS公司)及專用軟件(美國Media Cybernetics 公司Image-pro plus)；ABI7500型熒光定量PCR儀。

2 方法

2.1 造模方法

參考palmans等[3-4]方法制備慢性哮喘大鼠模型。

2.1.1 致敏 除空白組用生理鹽水外，其余各組動物均以新鮮配制的10%復合OVA抗原溶液(每1 ml抗原液中含有OVA100 mg，氫氧化鋁干粉100 mg)1ml進行腹腔注射致敏。在實驗的第1、8天各注射1次共2次，使大鼠致敏。

2.1.2 激發 在實驗的第15天將大鼠置于密閉的霧化箱內，由壓縮霧化器噴入1%的卵蛋白溶液30 min激發哮喘，隔天1次，連續6周。激發時大鼠出現呼吸急促，喘息，噴嚏，煩躁不安，行動遲緩甚至俯伏不動，連續激發后上述癥狀加重，毛色暗淡無光澤，活動減少，反應遲緩即為造模成功。

2.2 各組大鼠處理方法

2.2.1 針刺組 取穴肺俞(雙)、大椎、風門(雙)、足三里，每次激發前針刺隔日1次，連續6周。操作：常規消毒后以0.30 mm×13 mm針灸針直刺大椎、風門(雙)、肺俞(雙)、足三里，大椎直刺5 mm，風門、肺俞直刺6 mm，足三里直刺7 mm，每隔10 min均勻提插捻轉1次，每次留針20 min。

2.2.2 艾灸組 取穴同針刺組。每次激發前實驗人員手持細艾條行溫和灸法，使艾條距離上述穴位約2～3 cm，每次灸15 min，隔日1次，連續6周。

2.2.3 空白組和模型組 空白組按照模型制備方法，用生理鹽水代替卵蛋白；模型組按照模型制備方法造模，2組大鼠每天給予同樣的抓握刺激，不做任何治療。

2.3 取材方法

每組最后1次治療結束后24 h內用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.35 ml/100 g)，脫頸椎處死大鼠后迅速打開胸腔暴露心臟，用l0ml注射器抽取血液置于普通試管，靜置30 min，離心(3000 r/min，10 min)后取上清，-20 ℃保存。取右肺中下葉，用4 ℃生理鹽水將其漂洗干凈后，立即放入新鮮配制的4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肺組織病理學形態變化。取左肺組織黃豆粒大小，用4 ℃生理鹽水漂洗血跡，放入DEPC處理過的2 ml凍存管內，投入液氮罐，3 h內置-70 ℃冰箱凍存，待用于RT-PCR檢測。

2.4 肺組織病理切片

肺組織常規石蠟包埋，二甲苯脫蠟，經各級乙醇至水洗，蘇木素染色，常規脫水、透明、中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織病理形態學變化。

2.5 血清IL-5、IFN-γ含量測定

采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定大鼠血清 IL-5、IFN-γ含量，具體步驟按照試劑盒說明書操作。

2.6 肺組織T-bet、GATA-3mRNA檢測

表1示，用Trizol提取組織樣本中總RNA，使用PCR儀將1 μg總RNA反轉錄為cDNA，各樣品目的基因和內參基因引物序列及其產物長度，PCR反應條件：95℃15 min，95℃10 s，58℃30 s，72℃30 s，40循環，可得到模板循環數與熒光強度的關系，其中橫坐標代表PCR反應的循環數，即Ct值。根據Real Time PCR原始檢測結果，按照2-△△ct相對定量計算公式，計算出各樣品的目的基因相對定量結果。

表1 T-bet、GATA-3基因定量PCR引物序列

圖1 各組大鼠肺組織切片HE染色(×400)

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠肺組織病理形態分析

空白組大鼠肺組織形態結構未見明顯異常，肺泡及肺泡間隔形態結構基本正常，支氣管管腔規則，無炎性細胞浸潤。模型組大鼠氣管、肺間質、小血管周圍可見大量炎性細胞浸潤，支氣管管腔狹窄，氣道黏膜水腫明顯，可見上皮細胞脫落。針刺組和艾灸組同樣可見氣管及其周圍炎性細胞浸潤，氣道黏膜水腫，但與模型組比較炎性細胞浸潤程度明顯降低。

3.2 各組大鼠血清IL-5、IFN-γ含量及肺組織T-bet、GATA-3mRNA表達

表2示，與空白組比較，模型組大鼠IL-5含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，針刺組和艾灸組IL-5含量均明顯降低(P<0.01)。與空白組比較，模型組大鼠IFN-γ含量明顯降低(P<0.01)，與模型組比較，針刺組和艾灸組IFN-γ含量均明顯升高(P<0.01)，針刺組和艾灸組血清IL-5、IFN-γ水平比較差異無統計學意義。

表2 各組大鼠血清IL-5、IFN-γ含量及肺組織T-bet、GATA-3mRNA表達水平比較

與空白組比較，模型組大鼠T-bet mRNA表達明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，針刺組和艾灸組T-betmRNA表達均明顯升高(P<0.01)。與空白組比較，模型組大鼠GATA-3 mRNA表達明顯升高(P<0.01)，與模型組比較，針刺組和艾灸組GATA-3mRNA表達均明顯降低(P<0.01)。針刺組和艾灸組肺組織T-bet、GATA-3 mRNA表達比較差異均無統計學意義。

4 討論

支氣管哮喘是一種免疫異常導致的變態反應性疾病，其中Thl/Th2失衡理論被認為是哮喘形成和發展的重要原因。Th2 細胞是CD4+輔助性T細胞的重要亞群，主要分泌IL-4、IL-5、IL-13、腫瘤壞死因子(TNF-a)等，其中IL-4主要促進B細胞增殖及IgE合成[5]，IL-5 能促進嗜酸性粒細胞的聚集，IL-13通過促進黏液分泌和加重氣道高反應性而引發哮喘。GATA-3是Th2細胞分化必不可少的轉錄因子，其表達在Th2譜系分化的細胞中顯著上調[6]。研究證明，GATA-3可以驅動Th2細胞分化和誘導Th2型細胞因子的表達，IL-4、IL-5 和 IL-13 的基因啟動子區域都包含有GATA-3的結合位點，GATA-3通過上調IL-4、IL-5等Th2型細胞因子的表達，加重氣道的炎癥浸潤，促進哮喘的發生和發展。另一方面，GATA-3還可通過抑制Thl特異性轉錄因子T-bet促進Th2細胞分化，對多種靶基因起到促進和抑制作用[7]。T-bet是Thl的特異性轉錄因子，在調節Th1譜系細胞發育中起關鍵作用[8]，能夠阻斷或抑制Th2的分化信號，還能誘導已經定向分化的Th2細胞向相反的Thl方向轉化。在T-bet基因完全敲除的大鼠能夠發現與過敏哮喘相類似的病理炎癥改變[9]。Th1細胞可分泌IFN-γ，IFN-γ與受體結合后能夠激活T-bet基因，促使細胞向Th1方向分化，對哮喘的慢性氣道炎癥具有明顯的抑制效果。本實驗研究顯示，哮喘模型組大鼠血清IL-5含量及GATA-3 mRNA表達較空白組大鼠明顯升高，而血清IFN-γ含量及T-bet mRNA表達卻明顯降低，說明GATA-3可能一方面通過誘導Th2型細胞因子IL-5的表達，導致氣道炎癥的發生；另一方面也有效抑制Thl分泌細胞因子IFN-γ，阻斷其激活Thl特異性轉錄因子T-bet，從而引發哮喘。錢麗娟等[10]研究發現，GATA-3可直接調控哮喘小鼠肺組織中IL-5、IL-13表達，參與哮喘呼吸道炎癥的發生。這與本研究結果一致，說明針刺和艾灸可能是通過調控T-bet、GATA-3等轉錄因子的表達，從而影響IL-5、IFN-γ等細胞因子的分泌，進而糾正Thl/Th2失衡，發揮防治哮喘的作用。

本研究采用的技術方案以全國著名針灸專家邵經明集60余年經驗總結出來的哮喘經驗處方“邵氏五針法”為主。肺俞是肺的背俞穴，為治療肺系內傷外感諸疾之要穴，具有調補肺氣、祛邪解表、止咳平喘等作用；大椎屬督脈穴，為諸陽之會，具有宣陽解表、祛風散寒、理氣降逆、宣肺平喘之功；風門屬足太陽膀胱經穴，可疏風解表，調理肺氣，止咳平喘。輔以足陽明胃經的合穴足三里，具有健脾和胃、培土生金、扶助正氣之功。諸穴合用意在宣肺平喘，扶正固本，提高機體的抗病能力，減少哮喘的發作次數及嚴重程度。本研究中觀察到，哮喘模型大鼠氣道內大量炎性細胞浸潤，GATA-3表達升高，Th2細胞因子IL-5分泌增加，表現出明顯的向Th2細胞偏移。針刺組和艾灸組干預后，GATA-3mRNA及IL-5含量明顯降低，T-betm RNA表達明顯升高，Th1細胞因子IFN-γ分泌增加明顯，說明不論針刺或者艾灸均可通過調節哮喘大鼠Th1/Th2上下游基因及細胞因子T-bet、GATA-3、IL-5、IFN-γ的表達，使Th1/Th2失衡得以糾正，從而降低哮喘大鼠的氣道高反應性及慢性炎癥，達到防治哮喘的作用。