碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌對黏菌素和多黏菌素B的藥敏試驗方法學評價

郭 燕， 尹丹丹， 胡付品， 高晶晶， 何麗華， 吳文娟， 孫景勇， 倪語星， 湯 瑾，余佳佳， 劉 瑛， 田東興， 張 泓， 劉文健， 趙 虎， 李 敏

碳青霉烯類抗生素是治療多重耐藥革蘭陰性桿菌所致感染最有效的藥物之一[1]。隨著臨床上碳青霉烯類耐藥革蘭陰性桿菌的出現及在全球的流行播散，該類耐藥細菌已成為威脅人類健康的全球重大公共衛生問題。由于產碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌及一些多重耐藥銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌對多黏菌素類抗菌藥物耐藥率低，本類藥物重新成為多重耐藥革蘭陰性桿菌感染治療的選用藥物之一。對于黏菌素或多黏菌素B的藥敏試驗，當前歐洲共同體藥敏試驗委員會（EUCAST）和美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）僅推薦肉湯微量稀釋法可作為測定其最低抑菌濃度（MIC）的標準藥敏試驗方法[2]，但由于該藥敏方法在醫院臨床微生物實驗室尚難以開展，目前還在采用其他方法檢測多黏菌素的藥敏。為了解這些方法與標準肉湯微量稀釋法的差異，本次多中心研究納入上海市8所三級醫院，在規定時間內收集非重復的臨床上碳青霉烯類耐藥革蘭陰性桿菌統一進行方法學比較，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細菌來源 收集2018年9月1日－12月31日上海市8所教學醫院（包括7所綜合性醫院和1所兒童醫院）的臨床分離碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌1 040株，具體菌種和菌株數見表1，剔除同一患者相同部位重復菌株。中心實驗室在此期間將收集到的所有細菌復核鑒定確認后凍存于-80 ℃冰箱，待試驗開始時從低溫冰箱取出，復蘇和轉種后進行試驗。藥敏試驗質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853。

1.1.2 標準品 黏菌素（批號130327-200906，效價22740 UNITs/mg）和多黏菌素B（批號130313-201310，效價7791 UNITs/mg）購自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.3 藥敏試紙 ①多黏菌素B MIC測試條（MIC Test Strip，MTS）試紙系意大利利飛馳公司產品，測定的濃度范圍為0.06～1 024 mg/L；②多黏菌素B梳狀條（E strip）系溫州康泰公司產品，測定的濃度范圍為0.064～256 mg/L；③黏菌素E試驗條系法國生物梅里埃公司產品，測定的濃度范圍為0.016～256 mg/L；④黏菌素和多黏菌素B紙片系英國OXOID公司產品。

1.1.4 VITEK 2-Compact全自動細菌鑒定藥敏儀 革蘭陰性菌中國定制藥敏卡N335系法國生物梅里埃公司產品，測定的濃度范圍為0.5～16 mg/ L。

1.1.5 培養基和試劑 Mueller-Hintor瓊脂（MHA）為英國OXOID公司產品。肉湯微量稀釋法藥敏試驗用的陽離子調節肉湯（cation adjusted Mueller-Hinton broth， CAMHB）為美國BBL公司產品。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗方法 肉湯微量稀釋法按2018年CLSI M07-A11[3]（需氧菌的抗菌藥物稀釋法敏感性試驗）推薦的微量稀釋法進行，在本研究中為藥敏試驗方法學比較的參考方法（金標準）。紙片擴散法和各類試條的梯度擴散法按CLSI M02- A13[4]（抗菌藥物紙片敏感性試驗執行標準）推薦；VITEK 2-Compact及N335板卡按制造商說明書要求進行。

1.2.2 方法學評價指標[5]①基本一致率（essential agreement， EA）：被評估的方法檢測獲得的MIC與肉湯微量稀釋法獲得的MIC值相差±1個稀釋度的菌株百分比；②分類一致率（categorical agreement，CA）：按照折點標準，與參考方法相比，兩者獲得的敏感、中介、耐藥結果完全一致菌株的百分比；③小誤差（minor error，mE）：菌株在同一折點判斷標準下，評估方法將金標準方法做出的中介菌株判定為敏感或耐藥；④重大誤差（major errors，ME）：即評估方法將金標準方法做出的敏感菌株判定為耐藥（假耐藥）；⑤非常重大誤差（very major errors，VME）：即評估方法將金標準方法做出的耐藥菌株判定為敏感（假敏感）；⑥可接受誤差范圍為：EA和CA均 ≥90%、mE≤10%、ME≤3%和VME≤1.5%。

1.2.3 數據分析 采用WHONET 5.6軟件[6]進行藥敏結果的統計分析。折點可按CLSI M100（2019年版）的推薦[7]。如黏菌素為敏感≤2 mg/ L，耐藥≥4 mg/L；但多黏菌素B對銅綠假單胞菌敏感 ≤2 mg/L，中介4 mg/L，耐藥≥8 mg/L；對不動桿菌屬細菌敏感≤2 mg/L，耐藥≥4 mg/ L。C L S I目前沒有腸桿菌科細菌折點推薦，但其推薦流行病學界值（E C V）可判斷野生型（≤2 mg/ L）和非野生型（≥4 mg/L）。紙片法結果可分別采用CLSI M100（2016年版）[8]黏菌素（敏感≥11 mm，耐藥≤10 mm）和多黏菌素B（敏感≥12 mm，耐藥≤10 mm）對銅綠假單胞菌的折點進行判讀。

2 結果

2.1 黏菌素藥敏試驗方法結果比較

肉湯微量稀釋法、E試驗法、V I T E K 2-Compact和紙片擴散法藥敏試驗結果顯示，377株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（CRKP）對黏菌素的敏感率分別為97.3%、97.1%、96.3%和98.1%。317株碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌（CRPA）對黏菌素的敏感率分別為100%、95.3%、100%和99.1%。346株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌（CRAB）對黏菌素的敏感率分別為99.7%、100%、99.7%和99.7%。見表1。

與標準方法肉湯微量稀釋法結果相比，E試驗法檢測CRKP、CRPA和CRAB藥敏的EA分別為87.3%、88.3%和67.9%，E試驗法、VITEK 2-Compact和紙片擴散法檢測上述菌株的CA均 ＞95%。見表2～表4、圖1～圖3。

2.2 多黏菌素B藥敏試驗方法結果比較

肉湯微量稀釋法、MTS、E strip和紙片擴散法藥敏試驗結果顯示，377株CRKP對多黏菌素B的敏感率分別為98.1%、97.3%、97.3%和99.2%。317株CRPA對多黏菌素B的敏感率分別為100%、98.7%、99.4%和99.7%。346株CRAB對多黏菌素B的敏感率分別為99.7%、100%、100%和99.7%。見表1。

與標準方法肉湯微量稀釋法結果相比，MTS和E strip檢測CRKP、CRPA、CRAB的EA分別為13.8%和60.5%、65.0%和95.0%、31.8%和79.2%；而MTS、E strip和紙片擴散法檢測上述菌株的CA均＞98%。見表5～表7、圖4～圖6。

3 討論

2019年CHINET中國細菌耐藥監測結果顯示，腸桿菌科細菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為14.1%和13.5%、31.5%和26.7%、79.9%和80.4%，與2018年資料相比有增長趨勢[9]。碳青霉烯類耐藥的革蘭陰性菌使臨床抗感染治療面臨重大挑戰，WHO將其列入病原菌危險分類清單“嚴重致命”級別[10]。多黏菌素作為治療這類多重耐藥革蘭陰性菌感染的“重要藥物”，實驗室快速、準確地測定其藥敏試驗結果對臨床聯合抗菌藥物選擇至關重要。

表1 各種方法測定黏菌素和多黏菌素B的MIC分布Table 1 Distribution of colistin and polymyxin B MICs as determined by different metheds

目前國內臨床實驗室主要常規藥敏試驗檢測方法為自動化儀器。本研究結果顯示，VITEK 2-Compact法檢測317株CRPA和346株CRAB對黏菌素的藥敏，VME和ME均為0；而對于CRKP，VITEK 2-Compact法的CA為98.4%，但假敏感率為1/9，不在誤差可接受范圍內。Dafopoulou等[11]報道，采用VITEK 2-Compact法檢測41株碳青霉烯類不敏感肺炎克雷伯菌結果，VME為0，可推薦用作藥敏測定方法。然而2017年Chew等[12]采用相同儀器法檢測76株腸桿菌科的VME高達36%，認為誤差不可接受。可見，VITEK 2-Compact法檢測CRKP結果存在較大差異。

圖1 黏菌素E試驗、VITEK 2-Compact、紙片擴散法和肉湯微量稀釋法測定377株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌散點圖Figure 1 Scatter plot comparing the MIC values of colistin determined by Etest and VITEK 2-Compact， and the inhibition zone diameters of disk diffusion with the results of reference broth microdilution method when testing 377 strains of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

表2 不同方法測定碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌對黏菌素敏感性結果一致性比較Table 2 Discrepancy rates in the susceptibility of colistin against carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae by different methods

圖2 黏菌素 E試驗、VITEK 2-Compact、紙片擴散法和肉湯微量稀釋法測定317株碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌散點圖Figure 2 Scatter plot comparing the MIC values of colistin determined by Etest and VITEK 2-Compact， and the inhibition zone diameters of disk diffusion with the results of reference broth microdilution method when testing 317 strains of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa

表3 不同方法測定碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌對黏菌素敏感性結果一致性比較Table 3 Discrepancy rates in the susceptibility of colistin against carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa by different methods

圖3 黏菌素 E試驗、VITEK 2-Compact、紙片擴散法和肉湯微量稀釋法測定346株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌散點圖Figure 3 Scatter plot comparing the MIC values of colistin determined by Etest and VITEK 2-Compact， and the inhibition zone diameters of disk diffusion with the results of reference broth microdilution method when testing 346 strains of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii

表4 不同方法測定碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌對黏菌素敏感性結果一致性比較Table 4 Discrepancy rates in the susceptibility of colistin against carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii by different methods

圖4 多黏菌素B MTS、 E strip、紙片擴散法和肉湯微量稀釋法測定377株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌散點圖Figure 4 Scatter plot comparing the MIC values of polymyxin B determined by MTS and E strip， and the inhibition zone diametersof disk diffusion with the results of reference broth microdilution method when testing 377 strains of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

表5 不同方法測定碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌對多黏菌素B敏感性結果一致性比較Table 5 Discrepancy rates in the susceptibility of polymyxin B against carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae by different methods

圖5 多黏菌素B MTS、E strip、紙片擴散法和肉湯微量稀釋法測定317株碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌散點圖Figure 5 Scatter plot comparing the MIC values of polymyxin B determined by MTS and E strip， and the inhibition zone diameters of disk diffusion with the results of reference broth microdilution method when testing 317 strains of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa

表6 不同方法測定碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌對多黏菌素B敏感性結果一致性比較Table 6 Discrepancy rates in the susceptibility of polymyxin B against carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa by different methods

E試驗法操作簡單，結果定量，但在臨床實驗室開展較少。E試驗法檢測CRKP和CRAB的VME分別為1/9和1/1，而CRPA的VME為0，其總體ME為4.7%。據不同報道，E試驗法的VME從9.1%到55.5%不等[13-14]，均明顯高于CLSI誤差接受標準1.5%，本研究結果與之相似。MTS法和E strip法檢測原理、操作步驟與E試驗法相似，簡單且可獲得MIC值。本研究中，MTS法和E strip法檢測CRPA對多黏菌素B的敏感性、敏感率和CA均近100%，VME均為0， ME＜3%，而用于檢測CRKP和CRAB的VME分別為28.6%和33.3%，存在不可接受的假敏感率。Dafopoulou等[11]采用MTS法檢測41株CRKP和20株CRAB對黏菌素的藥敏，檢出的VME亦高達34.1%和25%。

紙片擴散法成本低，操作簡單，結果重復性好，廣泛用于微生物實驗室。由于目前無黏菌素和多黏菌素B的紙片法折點標準，為便于統計分析，本研究采用2016年CLSI標準中黏菌素和多黏菌素B對銅綠假單胞菌的折點進行判斷，結果顯示不同菌種間存在差異。采用2016年的折點，紙片擴散法檢測CRKP和CRAB的VME則高達33.3%～100%，均不可接受。Galani等[15]采用紙片擴散法測定黏菌素的藥敏，銅綠假單胞菌的VME為0；同樣的van der Heijden等[16]報道，CRPA對多黏菌素B的藥敏， VME高至100%。Gales等[17]采用敏感≥8 mm折點，黏菌素和多黏菌素B對革蘭陰性菌的VME為40%；采用敏感≥14 mm折點時，黏菌素的VME為23.3%。因此可見，紙片擴散法由于折點原因檢測黏菌素和多黏菌素B的藥敏存在較多爭議。

圖6 多黏菌素B MTS、E strip、紙片擴散法和肉湯微量稀釋法測定346株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌散點圖Figure 6 Scatter plot comparing the MIC values of polymyxin B determined by MTS and E strip， and the inhibition zone diameters of disk diffusion with the results of reference broth microdilution method when testing 346 strains of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii

表7 不同方法測定碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌對多黏菌素B敏感性結果一致性比較Table 7 Discrepancy rates in the susceptibility of polymyxin B against carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii by different methods

本研究中，共發現11株黏菌素耐藥株，1株為鮑曼不動桿菌，10株為肺炎克雷伯菌，其中1株鮑曼不動桿菌和7株肺炎克雷伯菌對多黏菌素B耐藥，耐藥株經復測結果保持一致。另外3株肺炎克雷伯菌對多黏菌素B敏感。根據國內流行病學情況[18-19]，選擇黏菌素耐藥基因mcr-1和mcr-3引物對上述耐藥株進行PCR分子生物學檢測，結果均為陰性（數據未羅列）。提示醫院分離菌株的黏菌素耐藥除了質粒介導的mcr基因外，可能還有陰離子莢膜多糖結合、外排泵活化、異質性耐藥等其他耐藥機制[20]。本研究尚未開展其他相關耐藥機制深入探索。

綜上所述，本研究中E試驗法、V I T E K 2-Compact法、紙片擴散法、MTS和E strip法等檢測碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌（CRKP、CRAB、CRPA）對黏菌素和多黏菌素B敏感性結果均存在EA偏低或假敏感現象（即VME），需引起實驗室和臨床高度重視。實驗室仍應按CLSI相關文件采用標準肉湯稀釋法進行多黏菌素藥敏試驗。此外，由于當前關于多黏菌素的臨床治療研究資料有限，實驗室在報告多黏菌素藥敏試驗結果時，應同時提供相關備注信息以提示臨床醫師，包括以下內容：① 同時報告多黏菌素的MIC值及其解釋分類。② 備注以下警示信息，即黏菌素的MIC值可用于預測多黏菌素B的MIC值；如應用黏菌素/多黏菌素B治療，應根據腎功能給予最大推薦劑量。③ 臨床和PK/PD 數據證實黏菌素和多黏菌素B 臨床療效有限，應聯合一個或多個有活性的抗微生物藥物。