慢性乙型肝炎患者外周血調(diào)節(jié)性T細胞、Th17細胞的水平及與乙肝表面抗原滴度的相關(guān)性

朱義玲， 甘建和， 趙衛(wèi)峰， 孫 蔚， 陳 麗

我國是慢性乙型肝炎（CHB）的高發(fā)區(qū)，相關(guān)調(diào)查顯示，目前我國乙型肝炎（乙肝）病毒表面抗原（HBsAg）攜帶率為7.18%，乙肝病毒（HBV）感染者高達9 300萬，其中CHB患者約2 000萬，占全世界的三分之一[1-2]。CHB的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸與機體的細胞免疫功能密切相關(guān)，尤其以效應(yīng)CD4+T淋巴細胞發(fā)揮的作用最為關(guān)鍵，其中調(diào)節(jié)性T細胞（Treg細胞）和Th17細胞在CHB中抗炎和促炎的作用已得到證實，且Treg/Th17比值的大小亦成為評估疾病嚴重程度的免疫指標(biāo)[3]，而HBsAg滴度水平是CHB患者能否成功治愈的關(guān)鍵，也是對HBV免疫控制比較直觀的指標(biāo)，因此本研究選擇相關(guān)病例進行Th17和Treg細胞的檢測，評估其與HBsAg的相關(guān)性及其在CHB發(fā)展過程中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

回顧性研究2018年1－12月在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染病科住院治療的CHB患者38例（乙肝組），男 29例，女9例，平均年齡（51.9±15.5）歲；乙肝肝硬化（LC）患者30例（肝硬化組），男25例，女5例，平均年齡（54.1±13.2）歲；選擇20名健康體檢者作為正常對照組，男15例，女5例，平均年齡（48.4±8.4）歲。患者納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《慢性乙型肝炎防治指南（2017年版）》。排除其他嗜肝病毒（甲、丙、丁、戊）感染；排除酒精性肝病及自身免疫性肝病；排除合并其他重大疾病。所有研究對象均知情同意，研究方案取得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑、儀器及檢測方法

1.2.1 流式細胞檢測 所用儀器為Beckman Coulter公司Epics XL4C。所用主要試劑分別為：BD公司的IL-17A-PE，Beckman Coulter公司的CD4-FITC、CD127-PE、CD3-ECD、CD25-PC5和C8-PC5。采集2 mL靜脈血于肝素抗凝管中，上下顛倒混勻 5 次，2 h內(nèi)送檢。

Th17細胞檢測步驟：因淋巴細胞刺激劑中的離子霉素和佛波酯會使淋巴細胞表面CD4分子表達明顯下降，有研究表明CD3+CD8-細胞可反映CD4+T細胞的數(shù)量[4]，故本實驗以CD3和CD8抗體作標(biāo)記，具體步驟如下，取 30 μL刺激劑（BD白細胞刺激劑：1640培養(yǎng)液=1∶50）加入 50 μL全血中，震蕩混勻于 37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育5 h，加入CD3-ECD 和 CD8-PC5各5 μL，震蕩混勻避光標(biāo)記15 min，加入100 μL固定劑震蕩混勻避光10 min，加入 1 mL PBS 震蕩混勻后1 500 r/min離心5 min 棄上清液，加入100 μL破膜劑震蕩混勻，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育10 min后1 500 r/min 離心5 min 棄上清液，加入IL-17A- PE 5 μL震蕩混勻避光標(biāo)記15 min，用500 μL PBS 重懸混勻后上機，計數(shù)3 000～5 000 個細胞。

Treg細胞檢測步驟：CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE 單抗各5 μL加入50 μL 全血中，震蕩混勻避光標(biāo)記15 min，加入自制的紅細胞裂解液 A 液600 μL，震蕩混勻至澄清約8 s加入B液265 μL，震蕩混勻后1 500 r/min離心5 min棄上清液，用 500 μL PBS重懸混勻后上機，計數(shù)3 000～5 000 個細胞。

以上經(jīng)上機采集的數(shù)據(jù)經(jīng)CXP軟件分析，獲得最終結(jié)果。

1.2.2 乙肝兩對半定量數(shù)據(jù) 采集靜脈血分離血清標(biāo)本，經(jīng)本科實驗室羅氏cobas e 411儀器檢測，獲得HBsAg定量的結(jié)果。相關(guān)生化數(shù)據(jù)均由本院臨床檢測中心完成。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用 SPSS 22.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理 ，計量資料符合正態(tài)性分布以x±s表示 ，非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，相關(guān)分析采用Spearson法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意 義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較

CHB組、LC組和健康對照組臨床資料見表1。三組研究對象性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義。CHB組和LC組的HBV-DNA及丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）指標(biāo)均高于健康對照組，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 Th17、Treg百分率及Treg/Th17比值比較

CHB組、LC組和健康對照組外周血Th17、Treg百分率、Treg/Th17比值見圖1和表2。與健康對照組比較，CHB組Treg、Th17百分率及Treg/Th17比值均明顯升高，且組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。CHB組與LC組比較，Treg、Th17百分率差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而Treg/Th17比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 CHB組Th17、Treg百分率及Treg/ Th17比值與HBsAg滴度的相關(guān)性分析

C H B組H B s A g滴 度 為6 4 7.8 8（1 8 5.8 1，1 009.85）IU/mL，HBsAg與Treg百分率具有統(tǒng)計學(xué)意義的正相關(guān)性（r=0.73，P＜0.05），而與Th17百分率（r=-0.16，P=0.35）及Treg/Th17比值（r=-0.05，P=0.77）無明顯相關(guān)性。見圖2。

表1 CHB組、LC組與健康對照組臨床資料比較Table1 Clinical data of chronic hepatitis B， hepatitis B cirrhosis compared with healthy subjects

圖1 健康對照組、 CHB 組和LC組Th17（CD3+CD8-IL-17+） 、Treg（CD4+CD25+CD127low）細胞流式圖Figure 1 Flow cytometry diagrams for Th17 cells （CD3+CD8-IL-17+） and Treg cells （CD4+CD25+CD127low） in healthy subjects，chronic hepatitis B， and hepatitis B cirrhosis.

表2 CHB組、LC組與健康對照組外周血Th17、Treg百分率、Treg/Th17比值比較Table 2 Th17， Treg cell percentage and Treg/Th17 ratio in peripheral blood compared between chronic hepatitis B， hepatitis B cirrhosis and healthy subjects

圖2 CHB組Treg與HBsAg的相關(guān)性分析Figure 2 Correlation between Treg and HBsAg in chronic hepatitis B patients

3 討論

我國是CHB高發(fā)國，每年因乙肝帶來的各種并發(fā)癥如肝硬化、肝癌、肝衰竭給社會和家庭帶來沉重的負擔(dān)，因此降低這些肝病的發(fā)生率，控制乃至完全治愈CHB是關(guān)鍵，但是在臨床治愈方面仍存在很多疑點和難點，可以肯定的是機體免疫功能與CHB各種臨床預(yù)后有著密切的相關(guān)性。

Treg細胞是T淋巴細胞亞群，在HBV 感染中高表達的 Treg細胞和樹突狀細胞數(shù)量減少及功能受損引起特異性CD8+T細胞數(shù)量減少及功能損傷，從而不能有效刺激機體產(chǎn)生特異性抗病毒免疫應(yīng)答[5-6]。另外，Treg細胞還可通過抑制固有免疫和適應(yīng)性免疫淋巴細胞的增殖及相關(guān)細胞因子的分泌，或通過細胞與細胞的直接接觸來持久性地抑制 CD8+T 細胞和 NK 細胞的細胞毒作用，減少免疫性肝損傷，而導(dǎo)致HBV 持續(xù)感染及原發(fā)性肝癌進展[7]。研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者外周血中 Treg細胞數(shù)量明顯高于 HBV 攜帶者、恢復(fù)期和健康者，且與HBV e抗原（HBeAg）滴度和血清 HBV-DNA 水平呈正相關(guān)[8]。

近年來，Th17細胞在CHB致病過程中的作用已得到證明，但目前的研究對于 Th17 細胞在CHB中的變化趨勢存在一定的爭論。Feng等[9]研究發(fā)現(xiàn)CHB患者外周血 Th17 細胞數(shù)量表達顯著上調(diào)，并與肝組織炎性活動程度呈正相關(guān)，Th17細胞誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，Treg細胞則抑制已經(jīng)發(fā)生的免疫炎性反應(yīng)，兩者相互作用使機體處于復(fù)雜而精細的 Treg/Th17 平衡狀態(tài)，維持機體免疫狀態(tài)的相對穩(wěn) 定。

為了進一步研究CHB患者的免疫狀態(tài)，本研究中檢測了38例CHB患者外周血的Treg、Th17百分率以及Treg/Th17比值，結(jié)果表明CHB患者這三者水平均較健康人明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；并對比了30例LC患者外周血的Treg、Th17百分率及Treg/Th17比值，前兩項數(shù)據(jù)差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。在CHB患者中， Th17細胞的增殖并釋放細胞因子如IL-17等引起免疫損傷，造成肝組織炎癥加劇，而Treg細胞亦相應(yīng)增加來抑制炎性活動從而緩和Th17細胞及其他免疫細胞帶來的免疫損傷[10]，提示CHB患者可能處于一種Th17細胞增多并趨于優(yōu)勢地位的Treg /Th17免疫失衡狀態(tài)，這可能是導(dǎo)致肝臟炎性反應(yīng)的重要因素。有研究顯示 HBV 攜帶者、CHB、靜止期肝硬化、活動期肝硬化患者 IL-17 的表達依次升高，提示 Th17 細胞及 IL-17 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)與 HBV 感染的嚴重程度及肝細胞損傷機制有關(guān)，這與本研究結(jié)果相符。因此，在CHB的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸過程中，檢測Th17和Treg細胞對預(yù)后評估有積極的作用。

HBsAg是HBV感染肝細胞后產(chǎn)生的重要抗原，HBsAg誘發(fā)的細胞免疫、體液免疫反應(yīng)對抑制HBV復(fù)制及殺滅病毒至關(guān)重要，且與HBV感染的進程及預(yù)后密切相關(guān)，在 CHB 病情發(fā)展的不同階段，血清 HBsAg 滴度呈現(xiàn)不同[11]。尹艷霞等[12]研究顯示HBeAg 陽性的 CHB患者，當(dāng)處于免疫耐受期時 HBsAg 定量最高，在HBeAg 陰性的低復(fù)制期患者中最低。因此，可以認為HBsAg與患者免疫功能水平密切相關(guān)，但關(guān)于這方面的研究鮮有報道，本研究檢測了CHB患者的HBsAg滴度，并將其與患者的外周血Treg、Th17百分率及其比值進行了相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CHB患者HBsAg與Treg百分率具有明顯的正相關(guān)性，而與Th17百分率以及Treg/Th17比值無明顯的相關(guān)性，考慮可能是因為CHB時，機體針對HBV的特異性免疫被激活，升高的HBsAg能夠刺激特異性細胞毒性T淋巴細胞（CTL）[13]，而Treg細胞則可以抑制過強的免疫應(yīng)答以免造成嚴重的免疫損傷如肝衰竭等，從而維持免疫穩(wěn)態(tài)， 但CHB患者大多數(shù)接受了抗病毒治療，HBV-DNA大部分均為陰性，而這可能干擾了Th17細胞水平的變化，進而影響HBsAg的清除。雖然這只是猜測之一，還需要更多的研究支持，但對免疫機制復(fù)雜的CHB，仍需更多的研究和探討。