NLRP3與炎癥因子及急性缺血性卒中預后的相關性研究

陽敏燕，王孟坤

缺血性腦卒中又稱腦梗死，是指因各種原因阻斷了腦部血液供應，引發(fā)腦組織缺氧、缺血性壞死，繼而出現(xiàn)神經功能缺失的一類疾病[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，炎癥是缺血性損傷的重要組成部分之一[2]。而NLRP3作為一種參與腦缺血再灌注損傷過程的蛋白復合物，最近被研究發(fā)現(xiàn)，其活性的上調可以引起IL-1β、IL-18、caspase-1等炎癥因子的釋放增加[3,4]，隨后導致細胞凋亡和炎癥，引起神經元損害，并加重腦損傷[5]。然而，NLRP3作為炎癥因子上游重要的通路調控因子，在人體中尚未得到充分的研究。在本研究中我們引入臨床上常見易得的指標mRS評分以及主要炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α，探討NLRP3與炎癥及急性缺血性卒中預后的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究序貫性納入2017年12月-2018年6月收治于成都市第四人民醫(yī)院內科病房首次確診的急性腦梗死的患者。納入標準：(1)年齡在 55～75 歲之間；(2)符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》中急性腦梗死的診斷標準[6]；(3)發(fā)病6～72 h內入院；(4)經計算機斷層掃描(CT)或磁共振成像 (MRI)結果確診為急性腦梗死患者。 排除標準：(1)短暫性腦缺血、腦出血、蛛網膜下腔出血、顱內血腫及其他出血性疾病者；(2)合并嚴重的感染；(3) 合并嚴重心、肝、 腎功能不全者；(4)伴有外傷、惡性腫瘤疾病者；(5)隨訪中丟失或退出研究的患者。患者入院后均予以常規(guī)抗栓、調節(jié)血脂水平、控制血壓等對癥支持治療。所有患者隨訪3個月，最終71人完成隨訪，并最終納入研究。同時從我院體檢中心招募38名健康志愿者作為對照。兩組研究對象的性別、年齡差異不顯著(P>0.05)，具有可比性。 本研究經成都市第四人民醫(yī)院倫理委員會審核批準。所有參與者或其親屬之前均簽署書面知情同意書。

1.2 樣本采集 測定兩組研究對象的NLRP3 mRNA水平。于發(fā)病后第3～72 h采取靜脈血2 ml，使用RT-qPCR檢測NLRP3 mRNA水平。定量RT-qPCR擴增產物及mRNA表達率使用2ΔΔCt測定，以GADPH作為內源性對照計算目的基因相對表達量。引物序列：NLRP3 Upstream F-5’-AAAGCCAAGAATCCACAGTGTAAC-3’，NLRP3 Downstream R-5’-TTGCCTCGCAGGTAAAGGT-3’；GAPDH Upstream F-5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，GAPDH Downstream R-5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。通過ELISA檢測血清炎癥因子(白細胞介素IL-6、IL-1β和腫瘤壞死因子TNF-α)表達水平，根據(jù)試劑盒說明書進行操作。

1.3 資料收集 收集所有參與者的臨床特征(年齡、性別)、當前吸煙、飲酒、高血壓、高脂血癥、高尿酸血癥、糖尿病情況。

1.4 對患者治療效果和預后的評價 患者的恢復情況，采用改良RanKin量表，根據(jù)發(fā)病3個月后，患者對日常工作及生活的完成程度進行計分，最低分為0分，最高分為6分。

2 結 果

2.1 臨床資料的收集以及一般因素的評定 人口統(tǒng)計學特征顯示，AIS患者的平均年齡和對照組分別為(63.7±12.4)歲和(61.1±10.3)歲；AIS患者中女性28例(39.4%),男性43例(60.5%);對照組女性14人(36.8%),男性24人(63.2%)。AIS患者和對照組之間在年齡 (P=0.713)和性別 (P=0.321)方面均無統(tǒng)計學差異，具有可比性。對于臨床基線資料，對照組的吸煙、飲酒、高血壓、高脂血癥、高尿酸血癥、糖尿病分別為12 (16.7%)、18 (16.7%)、14 (36.8%)、10 (26.3%)、5 (13.2%)、7 (18.4%)。AIS組則分別為22(30.9%)、27(38.0%)、33(46.5%)、35(49.3%)、19 (26.8%)、13 (18.3%)。與對照組相比，高血脂患者(P=0.030)和高尿酸患者(P=0.041)在AIS患者中增加，而吸煙(P=0.949)、飲酒(P=0.223)、高血壓病(P=0.537)、糖尿病(P=0.373)在兩組間沒有觀察到明顯差異。此外，與正常對照組相比，AIS組NLRP3 mRNA(P<0.01)水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(見表1)。

2.2 NLRP3水平與mRS評分的相關性 為了評估NLRP3作為生物標志物對于AIS患者恢復情況的預測效能，我們對發(fā)病3個月后患者的恢復情況進行了mRS評分。結果顯示，AIS組的mRS評分為(2.6±1.9)。進一步通過相關性分析我們還發(fā)現(xiàn)，NLRP3 的mRNA水平與mRS評分呈正相關(r=0.357,P=0.002)，提示血液中NLRP3 mRNA水平越高的AIS患者預后越差(見圖1)。

2.3 AIS患者血清炎癥因子的表達水平 為了了解NLRP3潛在的下游炎癥因子表達情況，我們通過ELISA檢測了血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度。結果顯示，AIS組IL-1β、IL-6、TNF-α 濃度明顯高于正常對照組，P值均<0.05，差異均有統(tǒng)計學意義 (見表2) 。

2.4 AIS患者NLRP3與炎癥因子的相關性 為了明確NLRP3與IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的關系，我們對它們進行了相關性分析，結果表明，AIS患者的NLRP3 mRNA水平與炎癥因子IL-1β(r=0.31,P=0.016)濃度呈正相關，而與IL-6 (r=0.07,P=0.751),TNF-α(r=0.14,P=0.186)無明顯相關性，表明可能是炎癥因子IL-1β介導了NLRP3的致病過程。

表1 人口學特征和臨床基線資料(n,%)

表2 兩組血清炎癥因子水平比較

圖1 NLRP3與mRS評分的相關性

3 討 論

在中樞神經系統(tǒng)(CNS)中，先天免疫反應在組織損傷或病原體入侵后的病理過程中起著至關重要的作用，其亦被稱為神經性炎癥，并以星形膠質細胞和小膠質細胞的激活為特征。越來越多的研究表明，炎癥是介導血管疾病病理生理的一個關鍵因素，包括腦血管疾病[7]。腦卒中患者血液中炎性因子(IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等)水平通常增高，而如果炎癥因子表達水平的急劇升高也常常提示預后不良[8]。炎癥因子與腦卒中患者的預后密切相關[2]。當患者發(fā)生腦灌注損傷時，機體會釋放出IL-1β、TNF-α等炎癥因子，觸發(fā)白細胞累積和中性粒細胞活化，導致中性粒細胞趨化。同時其還能引發(fā)氧化代謝物的產生，釋放出神經毒性物質，加重對腦組織的損傷。而隨著腦損傷程度的加重，又可進一步誘導血清IL-1β、TNF-α等炎癥因子的釋放。與既往研究報道一致，我們的研究結果發(fā)現(xiàn)，AIS患者血液中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平明顯高于正常對照組，該結果證實了炎癥因子在腦梗死發(fā)病過程中的重要角色。眾所周知，類節(jié)點受體(NLRs)是一類胞質傳感器或受體，它們對各種病原體相關分子模式(PAMPs)作出反應，這一反應與微生物和損傷相關分子模式(DAMPs)有關。而其中，NLRP3是各種研究的熱點，也是目前研究最多的一類NLRs，體外研究中表明，其在缺血性腦卒中炎癥反應中起重要作用[9]。NLRP3是一種新近發(fā)現(xiàn)的參與腦缺血再灌注損傷過程的蛋白復合物，NLRP3的激活可以引起IL-1β、IL-18、caspase-1等炎癥因子的釋放[3,10]。而NLRP3 siRNA可顯著減少的NLRP3表達以及其下游炎癥因子，同時也減少梗死體積,改善神經系統(tǒng)損害的結局[11]。本研究測定了NLRP3在急性腦梗死患者血液中的表達情況，結果顯示，急性腦梗死的血漿中NLRP3 mRNA水平明顯增高。我們進一步利用相關分析還發(fā)現(xiàn)，NLRP3 與炎癥因子IL-1β的表達具有正相關性，表明NLRP3確實是可能通過激活IL-1β等相關炎癥因子參與的AIS的疾病進展。為了評估NLRP3作為生物標志物監(jiān)測AIS患者預后的潛力，我們對起病3個月后的患者進行了隨訪，采用改良RanKin對預后進行評分，結果顯示AIS患者的NLRP3 mRNA水平與mRS評分呈正相關，提示NLRP3的表達越高，AIS患者預后越差。推測可能的機制是：(1)NLRP3觸發(fā)了炎癥反應級聯(lián)，導致了預后的惡化；(2)NLRP3可能激活或抑制了某些信號通路導致機體對抗栓藥物產生耐藥反應，抑制了治療效果，導致了AIS預后的惡化。但其潛在的分子機制仍有待進一步研究探索。

綜上所述，血液中NLRP3轉錄水平越高的AIS患者預后越差；此外，可能是炎癥因子IL-1β介導了NLRP3的致病過程。在今后的臨床工作中，對于缺血性腦卒中患者，尤其是入院后NLRP3值較高的患者，應早期重視并密切監(jiān)測。同時，NLRP3作為潛在的治療靶點，其參與腦卒中的分子機制研究也應當進一步完善。