線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發作綜合征的肌肉病理和電鏡特征

吳世陶，劉 方，石偉偉，張 敏，郭亞培，劉恒方

線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發作(mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes，MELAS)是由于線粒體DNA(mtDNA)或核DNA(nDNA)突變而導致線粒體結構和功能異常的一組綜合征。MELAS綜合征臨床表現復雜，容易漏診和誤診，肌肉活檢病理具有十分重要的診斷價值。電鏡能夠觀察肌肉細胞的微觀結構，為診斷MELAS綜合征提供形態學依據。我們總結33例MELAS綜合征患者肌肉病理及電鏡的特征，以提高對它們的認識。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月-2019年1月鄭州大學第五附屬醫院和鄭州大學第一附屬醫院經肌肉病理和基因測序同時確診的33例MELAS綜合征的資料，其中男20例，女13例，年齡4.2～39歲，病程2 m～10 y，多為青少年起病，主要臨床表現為癲癇、卒中樣發作、頭痛、身材矮小、不耐受疲勞、視力下降、聽力下降和多毛等。33例患者均發現基因突變位點。研究獲得鄭州大學第五附屬醫院倫理委員會的批準，且患者或家屬簽署知情同意書。

1.2 肌肉病理 患者或者監護人簽署知情同意書，局麻下獲得骨骼肌標本，根據病情取材部位為肱二頭肌或者腓腸肌。新鮮標本分兩部分，一部分行肌肉組織病理染色；另一部分行電鏡檢查。新鮮肌肉標本經液氮冷卻的異戊烷迅速冷凍，-80 ℃保存，染色時制成8 μm冷凍切片，進行蘇木精-伊紅(HE)、改良Gomori (MGT)、還原型輔酶Ⅰ四氮唑還原酶(NADH)、琥珀酸脫氫酶(SDH )、細胞色素C氧化酶(COX)、過碘酸雪夫氏(PAS)和油紅O(ORO)染色，顯微鏡200倍下進行病理分析，發現破碎紅纖維(RRF)后隨機選取10個視野計算RRF出現率，RRF出現率=(RRF個數/肌纖維總數)×100%。15例新鮮標本經2.5%戊二醛固定，行透射電子顯微鏡檢查。

2 結 果

2.1 肌肉病理 光鏡下HE染色可見部分肌纖維變性、壞死、萎縮，18例可見破碎紅纖維，其胞漿出現嗜堿性顆粒沉積。25例改良Gomori染色可見破碎紅纖維；26例NADH染色可見破碎紅纖維，氧化酶活性增高；28例SDH染色可見破碎藍纖維，氧化酶活性明顯增高；26例可見SSV現象，其中2例未見到破碎藍纖維和破碎紅纖維；22例COX染色光鏡下見到氧化酶活性消失或減低，即COX陰性肌纖維；15例PAS顯示糖原成分輕度增高；24例ORO染色可見脂肪成分增多(見圖1)。

2.2 電鏡 15例MELAS綜合征患者電鏡下均可見到肌原纖維排列紊亂、間質水腫，線粒體數量明顯增多，大部分聚集在肌膜下或者肌原纖維間，線

粒體嵴紊亂、體積增大，部分患者可見巨大線粒體，均可見到線粒體內結晶樣包涵體呈“停車場”樣排列(見圖2)。其中13例出現大量脂滴，9例糖原顆粒增多。此外，8例出現線粒體空泡化，5例溶酶體異常、脂褐素沉積，3例線粒體嵴呈同心圓排列，2例肌漿網擴張。

注：患者16，女，30歲，A：改良Gomori染色可見較多破碎紅纖維；B：COX染色可見破碎紅纖維氧化酶活性消失；C：患者29，男，7歲，SDH染色可見大量破碎藍纖維(黃箭頭)和SSV現象(紅箭頭)(×200)

注： A：線粒體數量增多、體積變大、腫脹、線粒體嵴紊亂；B:線粒體內大量結晶樣包涵體呈“停車場”樣排列(×10000)

3 討 論

肌肉病理對MELAS綜合征具有十分重要的診斷價值。本研究采用多種染色方法來觀察MELAS綜合征的病理改變，每種染色方法都有自己的特征。光鏡下HE染色可見肌纖維大小不一，部分肌纖維變性、壞死、萎縮，與部分患者的肌酸激酶和乳酸脫氫酶升高相關。破碎紅纖維(RRF)是指肌纖維內尤其是肌纖維膜下異常聚集的線粒體在改良Gomori染色上呈紅色且有破碎感，它的發生是由于線粒體功能障礙導致細胞能量供應不足、線粒體代償性增生以及大量聚集。研究報道80%～100%的MELAS綜合征患者肌肉活檢病理可以看到RRF[1]。本研究中75.8%(25/33)患者改良Gomori染色可見到大量典型的RRF，與既往研究基本一致[2]。但是，RRF并非線粒體病的特征性改變，RRF還可見于肌營養不良癥、多發性肌炎、包涵體肌炎、肌原纖維病、脂質沉積性肌病、中央軸空病和50以上的健康人等[3～5]。有學者認為RRF出現率大于4%才能診斷為線粒體病[6]，本研究也以RRF出現率大于4%為診斷標準。但是，肌肉活檢病理未發現RRF并不能排除MELAS，因為肌肉活檢取材具有局限性,RRF的分布具有隨機性。

酶學染色發現RRF的敏感性更高，本組研究酶學染色方法主要為NADH、SDH和COX染色。本組病例中78.9%(26/33)患者NADH染色可見破碎紅纖維，氧化酶活性增高，NADH是線粒體代謝過程中重要的酶，所以在異常線粒體聚集的肌纖維中表現明顯。肌纖維內或者肌纖維膜下異常聚集的線粒體在SDH染色上呈藍色，故稱為破碎藍纖維(ragged-blue fibers，RBF)。本組研究中84.8%(28/33)患者SDH染色可見到大量典型的RBF，氧化酶活性明顯增高，且RBF出現率較高，大約為10%，部分患者RBF的出現率高達30%，可見SDH染色發現異常線粒體的敏感性更高。此外，78.9%(26/33)患者見到肌間小動脈血管壁深染，即SSV現象，其中2例未見RRF和RBF，后經基因檢測確診為MELAS綜合征，說明SSV現象是MELAS綜合征肌肉病理的一個重要特點，SSV現象與RRF、RBF具有同等的診斷意義。Bennett等[7]報道大約85%的MELAS綜合征患者出現SSV現象。SSV現象提示小動脈平滑肌的線粒體異常，有報道認為SSV不僅存在于肌肉小動脈，也存在于腦小動脈血管，可使腦動脈血管壁的通透性增加而導致卒中樣發作[8,9]。COX是線粒體代謝過程中必不可少的一種酶，本組研究中66.7%(22/33)患者COX染色可見氧化酶活性消失或減低，即COX陰性肌纖維，這是MELAS綜合征肌肉病理的另外一個重要特點。

糖原累積癥、脂質沉積性肌病和線粒體病是最常見的代謝性肌病，糖原、脂質和線粒體共同參與細胞能量代謝[10,11]。本組研究中，45.5%(15/33)患者PAS染色顯示破碎紅纖維深染，提示糖原成分增多，說明線粒體代謝異常時糖原代謝也存在障礙。本組研究發現72.7%(24/33)患者ORO染色發現較多非破碎紅纖維的肌纖維內脂肪成分增多，其中破碎紅纖維內脂肪成分明顯增多，提示MELAS綜合征的肌纖維內脂質異常堆積，會影響線粒體內某些酶的功能，也是肌肉不耐受疲勞的一個原因。此外，肌纖維內脂質增加明顯者還應注意與脂質沉積性肌病相鑒別。

電鏡能夠十分清晰地看到肌纖維的微觀結構，能夠更好地觀察線粒體的異常。本組15例MELAS綜合征患者電鏡下均可見到線粒體內結晶樣包涵體呈“停車場”樣排列，是MELAS綜合征的典型特征。結晶樣包涵體的主要成分為線粒體肌酸激酶，其形成主要是因為線粒體ATP產生減少，線粒體肌酸激酶的功能發生代償而表達過度、酶活性降低而堆積的結果。線粒體肌酸激酶以二聚體及八聚體兩種形式存在，在一定條件下兩者可以相互轉化，pH較低時主要以八聚體的形式存在[12]。MELAS綜合征患者線粒體產生ATP不足，無氧酵解增加，產生大量的乳酸和H+，pH值降低，二聚體向八聚體轉化增多，促進了結晶樣包涵體的形成。此外，結晶樣包涵體是線粒體損傷不可逆性的標志[13]。MELAS綜合征患者電鏡下線粒體數量增多、體積增大、腫脹，線粒體腫脹可能和線粒體膜通透性轉換孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)有關。線粒體膜通透性轉換孔(mPTP)是位于線粒體內膜與外膜之間的一組通道蛋白復合體，pH下降、鈣超載和過量的活性氧都可使mPTP過度開放，從而導致線粒體基質的內滲透壓增高，引起線粒體腫脹[14]。總之，電鏡發現線粒體的異常比肌肉病理更加敏感，但是，由于電鏡取材較少，而且再經過超薄切片，電鏡正常者并不能排除MELAS綜合征。

綜上所述，破碎紅纖維(RRF)、SSV現象和COX陰性肌纖維是MELAS綜合征主要的肌肉病理改變。SDH染色是發現破碎紅纖維最敏感的方法，SSV現象可以是MELAS綜合征唯一的肌肉病理改變，具有診斷價值。電鏡下線粒體數量增多、體積增大、嵴結構紊亂，結晶樣包涵體呈“停車場”樣排列是MELAS綜合征的典型改變。充分認識MELAS綜合征的肌肉病理和電鏡特征，有利于提高MELAS綜合征的診斷，減少漏診和誤診。