板藍根顆粒中水溶性成分HPLC 指紋圖譜研究

崔 曉，李 欠，楊 蘭，邱黛玉*

（1.甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅蘭州730070；2.甘肅農業大學農學院，甘肅蘭州730070；3.甘肅省中藥材規范化生產技術創新重點實驗室，甘肅蘭州730070；4.青島市中心醫院藥劑科，山東青島266000）

板藍根顆粒收載于2015年版《中國藥典》一部中，是由板藍根煎煮醇沉后制成的單方中成藥，具有清熱解毒、涼血利咽的作用。現行版《中國藥典》僅在鑒別項下以精氨酸、亮氨酸為對照采用薄層色譜法進行鑒別[1]。現代藥理學研究發現，板藍根中的水溶性核苷類成分和（R,S）-告依春具有抗病毒的作用，可能是板藍根中的主要有效成分[2]，因此單純進行氨基酸薄層色譜法比對無法準確反映出板藍根顆粒的質量。

中藥指紋圖譜是指某些中藥材或中藥制劑經適當處理后，采用一定的分析手段，得到能夠標示其化學特征的色譜圖或光譜圖。HPLC 指紋圖譜因其操作簡便、適應性強、所含信息豐富等優點，被廣泛用于中藥飲片及其制劑的質量控制中[3-7]。本文建立了板藍根顆粒中水溶性成分HPLC 指紋圖譜，旨在為板藍根顆粒的質控標準提升提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 液相色譜柱（100×4.6 mm，5 μm）；CP255D 型電子分析天平（十萬分之一，德國賽多利斯公司）；AX124ZH 型電子分析天平（萬分之一，奧豪斯儀器常州有限公司）；Direct-Q 型純水機（美國Millipore 公司）；SCQ-7207C數控功率可調加熱超聲波清洗機（上海聲彥超聲波儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥品

腺苷對照品（批號Z23S7J21814；純度≥99%）、尿苷對照品（批號TM0313XA13；純度≥99.8%）、鳥苷對照品（批號AJ0609NA14；純度≥98.8%）、胞苷對照品（批號T16J7X9000；純度≥99.8%）、（R,S）-告依春對照品（批號Y17N9H75488；純度≥99.9%）、腺嘌呤對照品（批號T14N9Y74844；純度≥99.9%）均購自上海源葉生物科技有限公司。

表1 待測樣品信息

甲醇為色譜純，水為實驗室自制超純水。

1.3 樣品來源

試驗所用10 批市售板藍根顆粒均購自各藥品零售企業，樣品信息詳見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件的確定

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 液相色譜柱（100×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-水（B），洗脫梯度如表2 所示；檢測器波長254 nm，柱溫15℃，進樣量20 μL，流量1 ml/min，采集時間40 min。

表2 梯度洗脫程序

2.2 對照品溶液制備

精密稱取胞苷、尿苷、腺嘌呤、（R,S）-告依春、鳥苷、腺苷對照品適量，分別置于容量瓶中，加超純水稀釋至刻度線，混合均勻，定容至濃度為0.005 mg/ml 作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取板藍根顆粒適量，研細，稱取板藍根顆粒粉末約1 g（無糖型3 g 裝稱取約0.6 g）置于100 ml 錐形瓶中，精密量取超純水50 ml，稱定重量，蓋硅膠塞，超聲處理（400 W，40 KHz）5 min，放冷后稱量，補足減失的重量，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜即得。

2.4 中藥指紋圖譜方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取1.3 項下同一供試品（S7），按2.3 項下方法制備供試品溶液，使用2.1 項下色譜條件連續進樣6 次，以腺苷峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算相對標準偏差（RSD）。結果：各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的相對標準偏差（RSD）均不大于3%，表明該儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取1.3 項下同一供試品（S7），按2.3 項下方法平行制備6 份供試品溶液，使用2.1項下色譜條件分別進樣，以腺苷峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算相對標準偏差（RSD）。結果：各共有峰的相對保留時間的相對標準偏差（RSD）均不大于3%；相對峰面積的相對標準偏差（RSD）均不大于5%。表明該方法重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗 取1.3 項下同一供試品（S7），按2.3 項下方法制備供試品溶液，使用2.1 項下色譜條件分別在供試品溶液制備后0 h、2 h、6 h、10 h、24 h進樣，以腺苷峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算相對標準偏差（RSD）。結果：各共有峰的相對保留時間的相對標準偏差（RSD）均不大于3%；相對峰面積的相對標準偏差（RSD）均不大于5%。表明供試品溶液在室溫下存放24 h 內穩定。

2.5 指紋圖譜的建立

取收集的10 批板藍根顆粒供試品，按2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣記錄色譜圖。將所得色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.130723 版本），以S7 樣品作為參照，時間窗寬度設定為0.2 s，采用中位數法對色譜圖進行多點校正生成對照圖譜，見圖1、圖2。

2.6 參比峰的選擇和相對峰面積、相對保留時間的計算

共確定了9 個共有峰，通過與對照品進行比對，確定1號峰為胞苷、2號峰為尿苷、4號峰為腺嘌呤、5號峰為（R,S）-告依春、6號峰為鳥苷、7號峰為腺苷。7號峰（腺苷）分離度高、峰面積最大、峰位適中，因此選擇7號峰作為參比峰，分別計算其他共有峰與參比峰腺苷的相對峰面積和相對保留時間，結果見表3、表4。

2.7 相似度評價

通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.130723 版本）對10 批板藍根顆粒的指紋圖譜進行相似度計算，結果見表5。不同廠家、不同批次板藍根顆粒的相似度均≥0.954，表明不同廠家、不同批次的板藍根顆粒指紋圖譜相似度良好，且含糖顆粒與無糖顆粒指紋圖譜無明顯差異。

3 討論與結論

板藍根顆粒在制備過程中采用水煎煮法提取，采用超純水作為溶劑可以完全反映出板藍根顆粒中所含成分的情況。試驗對分析時間進行了考察，將供試品溶液注入高效液相色譜儀運行2 h，發現40 min后無明顯色譜峰出現，因此設定采集時間為40 min。

表3 板藍根顆粒指紋圖譜中共有峰的相對峰面積

表4 板藍根顆粒指紋圖譜中共有峰的相對保留時間

表5 10 批板藍根顆粒指紋圖譜相似度評價

研究發現，由于不同生產廠家選用藥材和制備工藝等因素的不同，板藍根顆粒中各共有峰的峰面積存在一定差異，因此求得相對標準偏差（RSD）較大，但軟件求得的相似度卻較高，可能是因為板藍根顆粒中尿苷、腺苷、（R,S）-告依春峰面積過大。

本試驗建立的板藍根顆粒中水溶性成分HPLC指紋圖譜共確定了9 個共有峰，通過與對照品比對，確定了其中6 個共有峰的成分。建立的指紋圖譜不受生產廠家、輔料等因素的影響，對含糖顆粒和無糖顆粒均有較好的適用性。因此，該方法簡便、可靠、適用性強，可作為板藍根顆粒質量控制的參考依據。