發酵液中透明質酸含量的快速估測方法

宋 磊,劉苗苗,郭燕風,王宜磊,*

(1.菏澤學院農業與生物工程學院,山東菏澤 274000;2.山東丹紅制藥有限公司,山東菏澤 274000)

透明質酸(hyaluronic acid,HA)是一種高分子酸性黏多糖,由N-乙酰葡萄糖胺與葡萄糖醛酸通過β-l,4和β-l,3糖苷鍵反復交替連接而成[1]。由于其獨特的流變學特性、黏彈性、保濕性及良好的生物相容性,在食品、化妝品、醫學領域都有廣泛的應用[2-5]。微生物發酵法生產透明質酸相對于從動物組織中提取具有周期短、產量高,環境友好等優點,是目前最主要生產方法[6-9]。

發酵液中透明質酸含量檢測多采用Bitter-Muir法[10-13],該方法步驟繁瑣,檢測時間長,誤差大;從取樣到檢測出結果至少需要3 h。微生物發酵周期一般不超過20 h,發酵高峰期只有7～9 h,利用該方法實時監測發酵液中透明質酸含量及判定發酵終止時間沒有太大指導意義。陳永浩等[14]提出CTAB比濁法快速測定搖瓶發酵液液中透明質酸,利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶液與HA溶液反應產生混濁的特性,通過反應體系的吸光度來反映其濁度,進而通過濁度與HA濃度的線性相關性估測發酵液中透明質酸含量。這種方法雖然在一定程度上減少了估測時間,但該方法研究取得的數據分析是基于搖瓶發酵培養,搖瓶發酵液受限于底物添加量、溶氧、pH持續降低等因素,透明質酸含量、菌體量、粘度等參數與工業生產有較大差距,因此利用此方法對企業規模化生產發酵過程中透明質酸含量估測不太準確。查閱國內外相關文獻,未見有對發酵液中透明質酸含量與發酵液狀態參數相偶聯,通過快速檢測狀態參數而快速估測透明質酸含量相關報道。陳莉等[15]提出了基于BP神經網絡快速估測發酵液中羊肚菌胞外多糖的含量;劉靜等[16]通過測定水溶液中濁度快速估測出水中殼聚糖含量,均取得了有益的研究經驗。

本文結合工廠實際生產經驗,通過對透明質酸液體深層發酵過程中透明質酸含量與發酵過程中幾個重要參數的相關性及變化規律分析,構建數學模型,以期能達到快速估測發酵液中透明質酸含量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發酵液 山東某生物工程公司提供;咔唑、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、四硼酸鈉 上海麥克林生化科技有限公司;硫酸、氫氧化鈉 天津市永大化學試劑有限公司;葡萄糖醛酸、葡萄糖標準品 國藥集團化學試劑有限公司。

PL203/01型分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DV2TRV型旋轉粘度計 美國博勒飛(廣州)有限公司;WGZ-200型濁度儀 上海昕瑞儀器儀表有限公司;HK338電導率儀 北京華科儀科技有限公司;UV5800型分光光度計 上海元析儀器有限公司;H1650型離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;DZF6090型真空干燥箱 上海皓莊儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵液取樣 透明質酸發酵周期短,發酵過程中各參數變化快。選定從發酵開始,間隔2 h取樣;取2019030901、2019031503、2019040201、2019060402、2019060501、2019060602六個發酵批次同一發酵時間節點發酵液300 mL,檢測其中透明質酸、菌體量、濁度、粘度、電導率、殘余糖含量。

1.2.2 菌體生長曲線及透明質酸含量變化曲線繪制 對上述六個批次同一時間節點測得菌體量、透明質酸含量取平均值,繪制曲線。

1.2.3 透明質酸含量與發酵液中各指標相關性分析 對上述六個批次同一時間節點測得透明質酸含量、菌體量、濁度、電導率、粘度、殘余糖含量取均值,利用軟件繪制發酵液中透明質酸含量與其他各參數相關性散點圖,并根據分析結果,考察其相關性。

1.2.4 構建數學模型 篩選出與發酵液中透明質酸含量變化規律相關性顯著參數,構建一元線性模型、二次項曲線模型、BP神經網絡模型,用于預測未知發酵液中透明質酸含量。

1.2.5 三種數學模型預測效果比較 對2020030101、2020030203其他兩個批次22個發酵液樣品中透明質酸含量及相關性顯著參數含量測定;利用一元線性回歸、二次項曲線回歸分析以及BP神經網絡3種數據處理方法獲得數學模型對發酵液中透明質酸含量進行估測;將實測值與模型估測值進行對比,依據試驗樣本方差作為3種模型的評價指標用于檢驗模型的準確性。方差計算公式

式中:S2表示方差;Y1表示數學模型計算值,g/L;Y2表示試驗測得實測值,g/L。

1.2.6 發酵過程中各指標測定方法

1.2.6.1 發酵液中透明質酸提取純化方法 將100 mL發酵液加入其2倍體積的酒精中,室溫下攪拌后靜置30 min,5400×g離心10 min,棄上清液,加400 mL純凈水溶解,升溫至60 ℃,加氯化鈉12 g,EDTA二鈉1 g,用1 mol/L氫氧化鈉調整pH至9.6,靜置30 min,過濾至澄清度≥99.5,即得供試樣品液。

1.2.6.2 發酵液中還原糖的測定 采用DNS法[17-18],稱取6.3 g 3,5-二硝基水楊酸(DNS)溶于少量蒸餾水中,加入2 mol/L氫氧化鈉溶液262 mL,再加入185 g酒石酸鈉鉀、5 g結晶酚、5 g亞硫酸鈉,搖勻,冷卻后定容至1000 mL棕色容量瓶中,于4 ℃冰箱中放置7 d備用。精密量取1.14 mg/mL無水葡萄糖對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于6個20 mL具塞試管中,補充蒸餾水至2 mL混勻,加入1.5 mL DNS試液,搖勻后置沸水浴保持5 min,冷卻至室溫,定容至刻度,搖勻。同時,以水為空白管對照,采用分光光度計測定540 nm波長處的吸光度。以吸光度(Y)為縱坐標,葡萄糖濃度(X)為橫坐標,繪制標準曲線。取透明質酸發酵液加純凈水適當稀釋后,取溶液1.0 mL置于20 mL具塞試管中,按照上述方法測定。根據標準曲線,計算供試品中還原糖的含量。

1.2.6.3 透明質酸測定 采用Bitter-Muir法[10-13],精密量取100 μg/mL葡萄糖醛酸標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分別置于20 mL具塞試管中,各加水至1.0 mL,混勻,冰浴中冷卻,并在不斷攪拌下緩緩加入硼砂硫酸溶液5.0 mL,密塞,沸水浴中加熱10 min,放冷。精密加入咔唑溶液0.2 mL,搖勻,沸水浴中加熱15 min,放冷。在530 nm波長處測定吸光度,以葡萄糖醛酸對應的吸光度計算回歸方程(回歸相關系數>0.999)。精密量取供試品溶液1.0 mL置于具塞試管中,按照上述方法,測定吸光度,從標準曲線上查出相應的葡萄糖醛酸含量。根據理論計算,HA分子中葡萄糖醛酸的含量為46.32%,故可根據葡萄糖醛酸含量除以46.32%即得HA含量。

1.2.6.4 發酵液粘度測定 采用數顯旋轉粘度計測定:控溫25 ℃,根據不同粘度,選擇合適轉子及轉速測定讀數。

1.2.6.5 電導率 控溫25 ℃,采用電導率儀測定。

1.2.6.6 濁度 對發酵液稀釋10倍后,采用濁度儀測定。

1.2.6.7 發酵液中菌體含量的測定 采取干重法[19],根據透明質酸發酵液粘度液稀釋至1000 mPa·s以下后離心取沉淀,洗滌一次,60 ℃真空干燥至恒重,稱取質量計算細胞濃度。

1.3 數據處理

采用Excel 2010軟件進行數據統計;SPSS 19.0軟件用于相關性分析、偏相關分析、一元線性模型及二次項曲線模型構建;Matlab2014軟件用于構建BP神經網絡模型;采用Orgin 9.1軟件進行繪圖。對六個批次發酵液測得各參數數據取均值用于相關性分析;六個批次各參數測得全部數據構建數學模型。

2 結果與分析

2.1 菌體生長曲線及透明質酸含量變化曲線

對六個批次同一時間節點測得菌體量、透明質酸含量值取平均值,繪制曲線。結果如圖1、圖2所示。

圖1 菌體生長曲線

圖2 透明質酸含量變化曲線

從圖1可知,0～2 h為菌體生長的調整期,菌體量很少;2～10 h為對數生長期,菌體快速生長繁殖;10～18 h菌體進入穩定期,菌體量始終保持在高位;18 h后進入衰亡期,菌體開始自溶。從圖2可以看出,0～6 h透明質酸產量很少;6～16 h透明質酸快速積累;18 h后細胞生長進入衰亡期,菌體開始裂解,逐漸釋放透明質酸酶,致使透明質酸開始降解,產量下降。

2.2 透明質酸含量與發酵液各參數相關性分析

由圖3可以直觀地看出,發酵液中透明質酸含量與還原糖含量、粘度相關、菌體量存在一定相關性,與電導率、濁度相關性不顯著。經Pearson相關檢驗分析,表1給出了透明質酸含量與菌體量、濁度、粘度、電導率、殘余還原糖含量各參數之間的相關性系數及檢驗顯著性水平。發酵液中透明質酸含量與發酵液濁度、電導率相關顯著性水平分別為0.081、0.192,均大于0.05,表明發酵液中透明質酸含量與發酵液濁度、電導率變化不存在相關性;發酵液中透明質酸含量與發酵液中菌體量、粘度、殘余還原糖變化顯著性水平分別為0.001、0.000、0.000,遠小于0.05,表明發酵液中透明質酸含量與發酵液中菌體量、粘度、殘余還原糖顯著性相關。

表1 透明質酸(HA)與各參數相關系數及顯著性水平

圖3 透明質酸(HA)與各參數相關性散點圖

單純利用相關系數來評價變量間的相關性還不夠準確,還需要在剔除其他相關因素影響的條件下,計算變量間的偏相關系數[15]。經偏相關分析,結果見表2。控制粘度及殘余還原糖含量兩個變量,透明質酸含量與菌體量相關性系數為0.137,顯著性水平為0.725,遠大于0.05,表明兩者存在虛假性相關。控制其他兩個變量,透明質酸含量與粘度、殘余還原糖變化規律呈顯著性相關,相關系數分別為0.984、-0.869,顯著性水平均小于0.01。這是由于發酵液中葡萄糖除了少部分用于菌體生長繁殖外,絕大部分用于合成透明質酸。其流程是葡萄糖經糖酵解(EMP)途徑形成6-磷酸果糖,然后在酶的作用下形成6-磷酸葡萄糖胺,進而合成交替地將尿苷二磷酸-N-酰基-氨基葡萄糖;尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸是通過糖醛酸途徑合成。菌體中透明質酸分子鏈的延長是從內源非還原端進行,透明質酸合成酶交替地將尿苷二磷酸-N-酰基-氨基葡萄糖和尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸以每分鐘約100個糖單位的速度快速添加到HA分子鏈上,同時逐漸增長的HA鏈會穿過質膜被送到胞外基質中[20]。故發酵液中透明質酸含量與還原糖含量變化表現出較強的相關性;透明質酸水溶液由于其分子內和分子間的作用,具有非牛頓流體的流變學特性及粘彈性。當透明質酸的濃度較低,溶液的粘度隨濃度變化相對較小,但濃度達到某一閾值時,溶液的粘度隨濃度的增加而快速提高,并表現出很強的的正相關性。結合兩變量相關性及偏相關分析,可用發酵液粘度與發酵液中殘余還原糖來描述預測發酵液中透明質酸含量,其中透明質酸與發酵液粘度在相關性與偏相關性更強,顯著性水平更低;此外考慮到發酵液粘度檢測可通過旋轉粘度計直接讀數,方法簡單;發酵液中還原糖含量檢測步驟繁瑣、時間長情況,選定發酵液粘度最為描述發酵液中透明質酸含量變化的唯一變量。

表2 透明質酸(HA)與各參數的偏相關系數

2.3 構建數學模型

取六個發酵批次66組實驗數據用于數學模型的構建,采用SPSS 19.0進行一元線性回歸和二項式曲線回歸分析;matlab2014構建BP神經網絡模型。公式中Y代表發酵液中透明質酸含量,X代表粘度。

2.3.1 一元線性回歸 對33組試驗數據進行一元線性回歸分析。結果如下:

Y=0.641+0.076X

經分析得,該線性方程復相關系數為0.993,判定系數R2為0.986,接近于1,初步表明擬合效果較好;模型殘差進行獨立性檢驗,DW=0.653,查詢Durbin Watson table可以發現本例DW值恰好出在無自相關性的值域之中,認定殘差獨立,通過檢驗;回歸方程顯著性檢驗的概率P=0.000<0.01,表明由自變量“粘度”和因變量“透明質酸含量”建立的線性關系回歸模型具有顯著的統計學意義。

2.3.2 二次項曲線回歸分析 二次項曲線回歸分析模型為:

Y=0.404+0.108X-0.00025X2

經分析得,回歸方程顯著性檢驗的F值為327.6,判定系數R2為0.995,回歸方程顯著性檢驗的概率P值為0.000,說明模型高度顯著。

2.3.3 BP神經網絡 BP神經網絡是一種按誤差反向傳播訓練的多層前饋網絡,具有很強的非線性映射能力,能很好地應用于非線性預測問題[21-23]。取上述66組實驗數據構建三層結構BP神經網絡[24-26],輸入層、輸出層各一個神經元,分別代表發酵液粘度和發酵液中透明質酸含量,輸入層到隱含層的傳遞函數為logsig函數,隱含層到輸出層之間選擇purline線性傳遞函數。網格訓練函數采用應用Levenberg-Marquardt優化后的trainlm訓練函數算法。經多次試錯法訓練選擇最佳隱含層神經元個數為10個,訓練13次后平均R值為0.9996。

2.4 三種數學模型預測效果比較

對2020030101、2020030203其他兩個批次22個實驗樣本進行發酵液粘度及發酵液中透明質酸含量檢測;依據發酵液粘度值利用一元線性回歸、二次項曲線回歸分析以及BP神經網絡3種數據處理方法獲得數學模型對發酵液中透明質酸含量進行估測;將實測值與模型估測值進行對比,實驗樣本方差作為3種模型的評價指標檢驗模型的準確性,結果如表3所示。

表3 三種模型檢驗結果

由表3可知,利用BP神經網絡模型的檢驗方差值最低為0.0189,表明利用BP神經網絡建立模型依據發酵液粘度對發酵液中透明質酸含量預測準確率最高,其次是二次項曲線回歸分析模型,一元線性回歸模型的準確率最低。

3 結論

在透明質酸發酵工業中,實時了解發酵液中透明質酸含量,對掌握發酵過程狀況、判定發酵終止時間、提前準備后續分離純化工作有很大的指導意義,找到一種準確快速估測發酵液中透明質酸含量的方法顯得尤為重要。通過對發酵液中透明質酸含量與菌體量、濁度、粘度、電導率、殘余糖含量變化規律的相關性分析,發現發酵液的濁度、電導率與透明質酸含量之間幾乎不存在相關性,發酵液中菌體量、粘度、殘余還原糖與發酵液中透明質酸含量變化相關性顯著,相關系數均在0.8以上。繼續偏相關分析,發酵液中菌體量與發酵液中透明質酸含量存在虛假相關,發酵液粘度與發酵液中殘余糖含量可作為描述發酵液中透明質酸含量的參數。考慮到發酵液中透明質酸含量與粘度相關性最為顯著且檢測方法簡單,選擇發酵液粘度作為描述發酵液中透明質酸含量的唯一參數。對構建一元線性回歸、二次項曲線回歸分析以及BP神經網絡3種數據處理方法獲得的數學模型進行驗證分析,三種模型根據發酵液粘度預測實驗結果方差分別為 0.2481、0.0646、0.0189,其中BP神經網絡預測效果最為準確。利用BP神經網絡構建數學模型只需將發酵液粘度代入模型即可準確快速測定透明質酸含量,從取樣到獲得結果,不超過20 min,極大縮短了檢測發酵液中透明質酸所需時間,對實時監測發酵液中透明質酸含量及判定發酵終止時間有重要意義。此文利用BP神經網絡構建模型只取了六個批次66組實驗數據,如能增大實驗樣本數量,重構的數學模型對實驗結果預測會更加精確;此外發酵液中粘度、還原糖含量均與透明質酸含量表現出了強烈的相關性,發酵液粘度和還原糖含量是否存在相關性,利用粘度是否可預測發酵液中殘余還原糖含量有待進一步研究。