發酵酸魚貯藏過程中理化與感官品質變化研究

孫穎瑛,許艷順,夏文水,姜啟興,高 沛

(江南大學食品學院,江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心,江蘇無錫 214122)

我國淡水魚資源豐富,種類多、產量大,但是由于淡水魚水分含量高,肌間刺多,土腥味重等問題,加工利用受到了嚴重制約[1]。發酵是一種傳統的食品加工和保藏技術,利用發酵技術有助于解決這些問題[2]。酸魚是我國具有地方民族特色的傳統發酵魚制品之一,以鯉魚或草魚為原料,經宰殺、腌制后與炒熟的谷物混合后密封發酵而成。發酵成熟的酸魚酸香爽口、營養豐富、風味濃郁,深受消費者的喜愛[3]。近年來,關于發酵魚制品的研究逐年增加,但現有的研究主要集中在發酵菌株的篩選、發酵工藝的改善以及對發酵過程中微生物、風味、脂質、蛋白、亞硝胺等的變化研究[4-9],目前關于發酵魚在貯藏流通過程中的品質變化及貨架期的報道甚少。

發酵魚中具有豐富的微生物和酶,在貯藏和流通過程中會對發酵魚中營養成分組成和感官品質產生影響,而溫度是影響微生物和酶活性的重要因素之一[10-11]。市售的酸魚產品貯藏條件多為冷藏和常溫,相同貯藏條件產品的保質期也有較大的差異。明確不同貯藏條件下發酵酸魚的品質變化特性對科學制定產品貯運條件和確定產品貨架期至關重要。因此,本文以感官評價、失水率、全質構、蛋白質組成、微觀結構等為主要指標評價,重點評價了發酵酸魚在冷藏(4 ℃),室溫(25 ℃)和極端溫度(35 ℃)不同貯藏溫度條件下的品質穩定性,旨在為提高發酵酸魚的貯藏穩定性和科學制定產品貨架期提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鯉魚、玉米粉、香辛料、調味料 均購于無錫歐尚超市(高浪店);發酵菌株 酵母菌、乳酸菌和葡萄球菌(1∶1∶1)混合,由本研究室于中國傳統固態發酵魚中分離純化制備;真空袋 中國美吉斯;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、無水乙醇、甲苯、冰乙酸、十二烷基硫酸鈉(SDS) 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

DHG-9070A型電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;4K-15型高速冷凍離心機 德國Sigma公司;YMX-958-10L型真空包裝機 泉州億閩信機電有限公司;單臂機型物性分析儀 英國SMS公司;4K15冷凍離心機 美國sigma公司;IKA-T10高速分散機 德國IKA集團;1150H徠卡石蠟包埋機 德國徠卡公司;PM2245徠卡手動輪轉切片機 德國徠卡公司;尼康ECLIPSE Ci生物顯微鏡 日本尼康株式會社;SCIENTZ-10ND凍干機 寧波新芝生物科技股份有限公司;su1510掃描電子顯微鏡 日本日立株式會社。

1.2 發酵魚的制備與貯藏試驗

鯉魚:鮮活鯉魚,去魚鱗魚脊骨、魚頭魚尾和內臟后,清洗,切塊,瀝干,按質量分數計,加入3%的食鹽,2%的白砂糖,2%的香辛料,攪拌混勻,置于4 ℃腌制48 h后,于烘箱50 ℃烘4 h,烘干后魚肉水分含量為68%～72%左右。

玉米粉:玉米粉中加入質量分數為3%的食鹽,2%的白砂糖,小火炒35 min,冷卻至室溫,接入活化的發酵菌株,充分混合后與冷卻至室溫的魚肉混合(烘干后魚肉質量∶玉米粉質量=4∶1)。

在發酵壇底部鋪上一層玉米粉后一層魚一層玉米粉壓緊,頂部鋪上玉米粉后壓實,加蓋加水密封,置于25 ℃下發酵5周。將發酵成熟的酸魚去除表面粘附的玉米粉后真空包裝,于4、25和35 ℃貯藏,貯藏過程中定期取樣分析。

1.3 分析方法

1.3.1 感官評價 發酵酸魚的感官評價參照于美娟等[6]的分析方法。在酸魚貯藏0、45和90 d期間對其外觀、滋味、氣味和口感進行感官評分分析,將酸魚切成1 cm×1 cm×1 cm的小塊,由挑選的12名(6男6女,年齡均在20～35歲之間)受過專業培訓的感官評定人員組成的評定小組對樣品的外觀、滋味、氣味和口感進行感官評定(總體可接受度為25%外觀+25%滋味+25%氣味+25%口感),評定標準見表1。

表1 發酵魚感官評價標準

1.3.2 失水率 失水率測定采用如下公式:

式中:W1-貯藏前發酵魚塊的質量,g;W2-貯藏后發酵魚塊的質量,g。

1.3.3 全質構分析 將魚肉切成1.5 cm×1 cm×1 cm的小塊,通過質構儀測定發酵魚肉的硬度、彈性、內聚性、粘著性、膠黏性和咀嚼性。測試條件:采用圓柱型測試探頭p/35,測試前速度為5 mm/s,測試速度為1 mm/s,測試后速度為5 mm/s,壓縮形變50%,觸發力5 g,每個樣品重復5次。

1.3.4 蛋白質組成 參考王蔚新[12]的方法提取發酵魚肉中各組分蛋白。稱取2 g攪碎的魚肉,加入20 mL 0.02 mol/L的磷酸緩沖液(pH6.5),均質1 min,10000×g離心20 min,重復提取兩次,合并上清液即為肌漿蛋白抽提液。剩余的沉淀部分繼續加入20 mL 0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH6.5,含0.7 mol/L NaCl),均質1 min,10000×g離心20 min,重復提取兩次,合并上清液即為肌原纖維蛋白提取液。沉淀部分重新懸浮于20 mL 5% SDS溶液,85 ℃水浴加熱1 h后用自來水冷卻,即為不溶性蛋白。各蛋白組分的含量采用雙縮脲法測定。

1.3.5 SDS-PAGE分析 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析全蛋白[3]。準確稱取2.0 g魚肉,加入18 mL 5% SDS溶液,均質后于85 ℃水浴加熱1 h后用自來水冷卻,將蛋白抽提液與2×樣品緩沖液等體積均勻混合,煮沸4 min后待測。濃縮膠濃度為5%,分離膠的濃度為10%,待凝固后上樣。濃縮膠部分電壓穩定在80 V、分離膠部分電壓調節為120 V。電泳結束后,用考馬斯亮藍R250染色液染色2 h,然后用脫色液過夜脫色。

1.3.6 微觀結構 微觀結構參照高琪等[13]的分析方法,并進行了一些改進。選取魚背肉,切成2 mm×5 mm×5 mm小塊,用carnoy溶液(60%無水乙醇,30%甲苯,10%冰乙酸)固定24 h,無水乙醇脫水2 h,50%無水乙醇和50%無水甲苯混合溶液浸泡12 h,無水甲苯透明4 h,石蠟浸泡包埋在徠卡手動輪轉切片機上制備10 μm厚的超薄切片,用毛刷將切片轉移至40 ℃水浴鍋中展開貼片,隨后將載玻片置于70 ℃烘箱中脫蠟1 h,無水甲苯洗脫20 min,無水乙醇、50%乙醇和去離子水各洗脫10 min,使用1%伊紅染色后,用生物顯微鏡觀察(放大倍數10×10)觀察拍照。

1.3.7 掃描電鏡 選取魚背部肌肉,切成3 mm×6 mm×6 mm小塊,用10%戊二醛固定3 d,乙醇梯度脫水,于-50 ℃預凍12 h,凍干48 h,用金涂覆至10 nm的厚度。通過掃描電子顯微鏡在電壓為20 kV下分別放大500和5000倍觀察魚肉組織結構特征。

1.4 數據統計分析

數據采用SPSS 25.0和Microsoft Excel 2016進行處理和分析,結果表示為“均值±標準差”。采用鄧肯多重分析(Duncan multiple analysis)進行組間顯著性分析,顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 貯藏溫度和時間對酸魚感官品質的影響

感官評分是發酵魚貯藏期間重要的評價指標之一,直接影響消費者的接受性。酸魚的感官評分結果如圖1所示。由圖1可知,貯藏溫度越高,時間越長,則酸魚的感官評分越低。隨著貯藏溫度的升高,貯藏時間的增加,從魚肉中遷移出來的水分越多,酸魚的外觀品質和口感越差。在4 ℃貯藏90 d后酸魚的感官品質變化較小,酸香味和口感保持較好,總體可接受度相對較高。在25 ℃貯藏45 d后總體可接受度相對較高,但是在貯藏90 d后口感評分下降較明顯,魚塊表面潮濕,肉質軟膩,總體可接受度降低。在35 ℃貯藏45 d時,發酵酸魚的感官品質已經出現明顯劣化,表觀變差,顏色變深,肉質變軟,從魚肉中滲出水分較多。

圖1 發酵酸魚儲藏過程中的感官分析比較

綜上所述,從感官品質方面可知冷藏(4 ℃)是最佳的保藏方式;在貯藏過程中發酵魚肉的外觀和口感是感官劣化的主要方面,均受時間和溫度影響較大。Mario等[14]和KameníK等[15]研究發現發酵香腸貯藏過程中也有相似結果,貯藏溫度越高,則顏色和口感方面劣化明顯,感官品質越差。

2.2 貯藏溫度和時間對酸魚物性指標的影響

2.2.1 貯藏失水率 發酵魚在貯藏過程中的失水率如表2所示,隨著貯藏時間的延長,發酵酸魚的失水率呈上升趨勢,隨著貯藏溫度的升高,發酵魚的失水率增加。在整個貯藏過程中,貯藏前30 d失水率增加相對顯著(P<0.05)。4、25和35 ℃貯藏90 d后的發酵魚失水率由最初的2.72%分別增加至4.14%、6.76%和9.51%。pH是影響肌肉蛋白持水性的主要因素之一,酸性條件下蛋白變性導致持水性下降。此外,在貯藏過程中魚肉肌肉蛋白質發生了一定程度的變性與降解,肌原纖維發生了收縮,引起可存儲水分的網絡空間結構變小,也會導致失水率增加[16-18]。失水率的增加引起魚肉中水分向外遷移至包裝袋中,導致酸魚感官品質的可接受程度也隨之降低。

2.2.2 質構分析 質構是評價魚肉品質的重要指標之一,發酵魚在貯藏過程中質構變化如表3所示。貯藏早期是硬度變化的主要階段,低溫貯藏的樣品具有相對穩定的質構。在貯藏過程中,發酵魚在4、25和35 ℃貯藏30 d后的樣品硬度值分別上升至最初硬度值的1.23、1.32和1.41倍,30 d后硬度的變化趨于平緩(P>0.05),且貯藏溫度越高,發酵魚的硬度值越大。貯藏期間硬度值的增加主要與貯藏過程中水分的流失有關,溫度越高則失水率越高,因此溫度越高則硬度值越大。李苗云等[19]在火腿腸的貯藏過程中也有相似的研究結果。在貯藏過程中發酵魚肉的彈性和黏聚性值的變化較小,貯藏期間所有樣品的彈性值在0.44～0.67范圍內,而黏聚性值在0.43～0.58范圍內。與25和35 ℃貯藏的樣品相比,4 ℃貯藏的樣品在整個貯藏過程中具有相對穩定的咀嚼度值(P>0.05)。

表3 發酵魚在貯藏過程中全質構的變化

2.3 貯藏溫度和時間對酸魚蛋白質的影響

2.3.1 蛋白質組成 蛋白質是魚肉的主要組分,與發酵酸魚品質變化密切相關。魚肉中蛋白質可以分為肌漿蛋白(sarcoplasmic protein)、肌原纖維蛋白(myofibrillar protein)和不溶性蛋白(insoluble protein)。肌漿蛋白是水溶性蛋白,存在于肌細胞間及肌原纖維間;肌原纖維蛋白屬于鹽溶性蛋白,存在于肌原纖維中;而不溶性蛋白是不能溶于鹽溶液和堿溶液的蛋白組分,主要包括由網狀蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白組成的基質蛋白和變性蛋白[20-21]。酸魚各蛋白組分在貯藏過程中的含量變化如表4所示。

表4 發酵魚在貯藏過程中蛋白組成的變化

從表4可以看出,在貯藏過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量均隨著貯藏時間的延長而降低,貯藏90 d后,分別下降至貯藏前樣品的53.46%～69.50%和63.29%～70.16%,而不溶性蛋白含量隨貯藏時間的延長而增加,90 d后增加至貯藏前樣品的1.13～1.38倍。貯藏溫度越高,蛋白組成變化越大,低溫可以有效延緩蛋白組分的變化。不同蛋白組分含量變化,一方面可能是由于水溶性蛋白隨著水分的遷移而部分滲出,另一方面酸魚在儲藏過程中pH維持在4.0左右,酸性條件下肌漿蛋白和肌原纖維蛋白發生變性和聚集,從而導致不溶性蛋白質增加[22-23]。

2.3.2 蛋白電泳 采用SDS-PAGE電泳對發酵魚在保藏過程中的全蛋白變化進行了分析。由圖2可知,貯藏時間對蛋白條帶的影響較小,貯藏溫度對蛋白條帶的影響較大。與剛發酵成熟酸魚的蛋白電泳條帶圖相比,4 ℃貯藏的樣品在貯藏45和90 d后蛋白條帶顏色變淺,但條帶數量的變化較小;25 ℃貯藏的樣品蛋白條帶顏色變淺,25～37 kDa之間的條帶變窄;而相對于其它組樣品,35 ℃貯藏的樣品在貯藏45 d后,全蛋白20～25 kDa之間、37 kDa左右、75～250 kDa之間的蛋白條帶消失,25～37 kDa之間、37～75 kDa之間的蛋白條帶變窄,顏色變淺。根據電泳圖發現,發酵酸魚在貯藏過程中蛋白有一定程度的降解,35 ℃蛋白降解更加劇烈,這主要與內源性組織蛋白酶和微生物蛋白酶的作用將魚肉蛋白形成小分子肽和游離氨基酸等有關[24]。

圖2 發酵酸魚儲藏過程中的全蛋白電泳圖譜

2.4 貯藏溫度和時間對酸魚組織結構的影響

2.4.1 光學顯微結構 組織結構是影響肉制品口感的主要因素。發酵酸魚在貯藏過程中微觀組織結構的變化如圖3所示。由圖可知,三種貯藏溫度下發酵魚肉的組織結構變化趨勢相似。剛發酵成熟的魚肉肌肉纖維排列致密整齊,纖維間隙少且小。隨著貯藏時間的延長,肌纖維內部間隙逐漸增大,貯藏溫度越高則肌纖維內部間隙越大。貯藏過程中由于蛋白質降解和酶的作用,魚肉肌纖維和連接肌纖維的肌膜逐漸脫離,形成纖維間間隙,貯藏溫度越高,單個肌纖維收縮越劇烈,肌纖維直徑越小,間隙越大[25]。

圖3 發酵魚在貯藏過程中微觀組織結構的變化(100×)

2.4.2 掃描電鏡分析 貯藏溫度對發酵魚超微結構的影響顯著,圖4是發酵魚發酵成熟和不同溫度下貯藏90 d后的500×和5000×的掃描電鏡圖,從圖中可以很直觀地觀察到發酵魚貯藏90 d后肌肉纖維的變化。掃描電鏡放大500倍觀察,剛發酵成熟的酸魚樣品肌纖維相對緊密,裂縫相對較少,貯藏90 d后的樣品貯藏溫度越高肌肉裂縫間距越大。35 ℃肌肉收縮,肌膜松散,肌纖維之間的間距增大,與光學顯微鏡觀察的結果基本一致。在放大5000倍的圖像中可以觀察到剛發酵完成的酸魚樣品纖維結構相對平整,4 ℃貯藏的樣品次之,25和35 ℃貯藏的樣品肌肉纖維斷裂相對明顯。貯藏過程中,發酵魚肉中蛋白質的降解導致了肌肉組織結構變化,肌肉的肌節發生了聚合或收縮,進而加大了肌纖維間間隙,酶的作用也會降解結締組織導致肌纖維與肌膜發生脫離,增大間隙[26-27]。

圖4 發酵魚在貯藏過程中掃描電鏡圖

3 結論

發酵酸魚在4、25和35 ℃貯藏90 d,貯藏溫度和時間均對發酵魚的感官品質、物性特征、蛋白質和微觀組織結構有顯著的影響。貯藏溫度越高,則發酵魚的感官品質劣化越嚴重,貯藏過程中失水率越多,硬度越大,蛋白質降解越劇烈,微觀結構變化越大。隨著貯藏時間的延長,感官品質發生劣化,肌漿蛋白和肌原纖維蛋白逐漸變性聚集,不溶性蛋白逐漸增加,肌纖維間間隙不斷變大,水分流失和硬度的變化主要發生在貯藏前期。低溫(4 ℃)有助于保持發酵魚產品的感官品質和質構,減少水分流失,延緩蛋白的降解和肌肉纖維結構的變化。隨著貯藏時間的延長,發酵魚的品質整體上會發生不同程度的下降,但4 ℃冷藏產品整體品質相對穩定。