復合酶法提取黃秋葵可溶性膳食纖維的工藝優化及其理化特性、結構表征

梁文康,蘇 平,魏 丹

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院,浙江杭州 310058)

黃秋葵(Abelmoschusesculentus(L.)Moench)為錦葵科、秋葵屬的草本植物,原產自非洲、南亞等熱帶或亞熱帶地區,引入中國后,在江浙、兩湖和廣東等地區被廣泛種植[1]。黃秋葵是目前廣受青睞的新型蔬菜,不僅口感嫩滑、味道鮮美,而且具有很高的營養價值,黃阿根等[2]測定黃秋葵果莢中的蛋白質和總糖含量均接近20%,黃酮物質的含量超過2%。膳食纖維是一類重要的生物活性物質,被稱為第七大營養素,王琰等[3]證實黃秋葵果莢中總膳食纖維含量高達40%,其中可溶性膳食纖維(SDF)達到膳食纖維總含量的20%以上。黃秋葵果莢的提取物具有較好的抗氧化性,以及降低血糖、緩解機體疲勞等多種生理功能[4-7],可作為膳食纖維的良好來源,用于制備具有多種功能特性的膳食纖維食品。

膳食纖維的常用的提取方法有酸堿提取法[8]、酶解法[9]和微生物法[10]等。酸堿提取法成本低,操作簡便,應用最廣泛,但易造成溶劑殘留,且強酸或強堿環境會造成纖維素、半纖維素等組分的損失,使提取得到的膳食纖維的生理活性受到影響[8]。酶提取法雖然成本略高于化學溶劑法,但不容易破壞被提取物的結構,使其功能性得到良好的保持[11]。目前關于黃秋葵膳食纖維提取的研究較少[12],常用的方法為酸堿提取法。韋鷺等[12]對酸水解法提取黃秋葵膳食纖維的工藝進行優化,最高得率為12.65%。而黃秋葵膳食纖維的酶法提取尚未見報道。

因此本研究以黃秋葵果莢為原料,采用酶解法提取黃秋葵可溶性膳食纖維,通過響應面實驗探究黃秋葵可溶性膳食纖維得率最高時的工藝參數。對提取產物進行結構表征,探究提取前后黃秋葵可溶性膳食纖維的結構變化,同時測定黃秋葵可溶性膳食纖維的理化性質,以此為基礎可進一步研究黃秋葵可溶性膳食纖維的生理功效,也為黃秋葵保健食品的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃秋葵 由嘉興市捌零壹農業生物科技有限公司提供,產自浙江嘉善;α-淀粉酶(4000 U/g)、糖化酶(10萬U/g)、中性蛋白酶(10萬U/g) 上海源葉生物科技有限公司;乙醇、鹽酸、氫氧化鈉(均為分析純) 國藥集團化學試劑有限公司;花生油 市售。

JA1003N電子天平 上海菁海儀器有限公司;PH070A鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司;UV-2550紫外可見分光光度計 日本Shimadzu公司;Multiskan GO全波長酶標儀 美國Thermo公司;Nicolet iS10傅立葉紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技公司;D8 Advance X射線衍射儀 德國布魯克科技有限公司;SU-8010 冷場發射掃描電子顯微鏡 日本日立公司;TGL20M高速冷凍離心機 湖南凱達科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃秋葵SDF的提取

1.2.1.1 工藝流程 黃秋葵果莢→干燥→粉碎→復合酶酶解→滅酶→蛋白酶酶解→滅酶→離心→收集濾液→醇沉→收集沉淀→真空冷凍干燥→黃秋葵SDF

1.2.1.2 操作要點 a.預處理:黃秋葵果莢清洗后切分成2～3 cm的小段,55 ℃熱風干燥12 h,粉碎后過40目篩,密封后放置于干燥器中備用。

b.復合酶酶解:參考文獻[13]中使用α-淀粉酶(最適pH為6.0～7.0)和糖化酶(最適pH為4.5)復合提取可溶性膳食纖維的方法,準確稱取充分干燥后的秋葵粉樣品2.00 g,加入一定體積的蒸餾水,將溶液pH調節至6.5,加入一定量的α-淀粉酶和糖化酶等比例混合的復合酶,在適宜溫度下的水浴中保持一段時間,期間不斷攪拌;

c.滅酶:提取液放入100 ℃水浴中,滅酶5 min;

d.蛋白酶酶解:將提取液冷卻至室溫,調節pH至7.0,加入質量濃度為1.0%的蛋白酶,在50 ℃水浴中保持60 min,期間不斷攪拌;

e.滅酶:蛋白酶處理后的提取液放入100 ℃水浴中,滅酶5 min;

f.醇沉:提取液離心,離心條件為5000 r/min,15 min。收集上清液,加入四倍體積的95%乙醇,靜置12 h后過濾,收集濾渣,真空冷凍干燥后得到黃秋葵可溶性膳食纖維。

1.2.2 單因素實驗 準確稱取黃秋葵粉2.00 g,置于50 mL離心管中,以復合酶的質量濃度1.5%、復合酶酶解時間60 min,復合酶酶解溫度60 ℃、料液比1∶20為基本條件,通過改變單一因素來探究其對黃秋葵SDF提取造成的影響。料液比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL;復合酶添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%;復合酶酶解時間分別為20、40、60、80、100 min;復合酶酶解溫度分別為40、50、60、70、80 ℃。具體步驟如1.2.1所述,研究各個因素對黃秋葵SDF提取得率的影響。

1.2.3 響應面試驗 使用軟件Design Expert 10.0,方法選用Box-Behnken,自變量為料液比(A)、復合酶添加量(B)、復合酶酶解時間(C)、復合酶酶解溫度(D),響應指標即秋葵SDF得率。根據之前單因素試驗的結果,確定了自變量的試驗水平如下:

1.2.4 黃秋葵SDF得率的計算 計算公式為:

式(1)

式中:m為干燥后可溶性膳食纖維的重量(g);M為干燥后秋葵粉的重量(g)。

1.2.5 黃秋葵SDF理化性質測定

1.2.5.1 持水力的測定 持水力(water holding capacity,WHC)即在除重力、大氣壓力之外的外力作用情況下樣品結合水分的能力。測定方法:準確稱取1.00 g樣品,加水30 mL,振蕩均勻后在37 ℃水浴中放置12 h,以4000 r/min,離心15 min后稱重,按照式(2)計算黃秋葵膳食纖維的持水力[14]:

式(2)

1.2.5.2 膨脹力的測定 膨脹力(swelling capacity,SC)即樣品充分吸收水分后,所占的體積與未吸水前實際體積的差值。測定方法:準確稱取2.00 g樣品,置于100 mL量筒中,加蒸餾水60 mL,充分混合后在4 ℃下放置24 h,記錄樣品吸水前后的刻度值。按照式(3)計算黃秋葵膳食纖維的膨脹力[15]:

膨脹力(SC)=(樣品吸水后刻度(mL)-初始刻度(mL))/樣品粉重量(g)

式(3)

1.2.5.3 持油力的測定 持油力(oil holding capacity,OHC)即在不受除重力、大氣壓力之外的外力作用情況下樣品結合油分的能力。測定方法:準確稱取1.00 g樣品,加花生油10 g,振蕩均勻后在37 ℃水浴中放置12 h,以4000 r/min,離心15 min后稱重,按照式(4)計算黃秋葵膳食纖維的持油力[16]:

持油力(OHC)=(樣品結合油后重量(g)-樣品粉重量(g))/樣品粉重量(g)

式(4)

1.2.6 黃秋葵SDF的結構表征

1.2.6.1 掃描電鏡觀察顯微結構 按照文獻[17]中的方法對黃秋葵SDF及黃秋葵粉進行處理,使用掃描電鏡觀察黃秋葵SDF及黃秋葵粉的顯微結構,觀察在100倍和5000倍兩個放大倍數下二者的表面形態。

1.2.6.2 傅里葉紅外光譜分析 樣品在50 ℃烘箱中干燥24 h,溴化鉀粉末在105 ℃烘箱中干燥24 h。取2 mg樣品和200 mg 溴化鉀混合,在紅外燈下充分研磨。將混合均勻的粉末壓制成薄片,使用紅外光譜儀掃描[18],掃描波數為400～4000 cm-1,分別記錄黃秋葵SDF和黃秋葵粉的紅外光譜曲線并分析。

1.2.6.3 X射線衍射分析 按照文獻[19]中的方法進行樣品的準備及分析參數的設置。樣品在50 ℃烘箱中干燥24 h,使用X射線衍射儀分析,陽極靶為Cu,X射線波長λ=0.156 nm,工作電壓40 kV,管流20 mA,掃描范圍5°～70°,掃描間隔0.02°。分別記錄黃秋葵SDF和黃秋葵粉的X射線衍射圖譜并分析。

1.3 數據處理

所有數據均重復3次取平均值,使用SPSS 18.0進行單因素方差分析,使用Origin 8.0進行圖表的制作與處理。數據采用平均值±標準差的形式表示。

2 結果與分析

2.1 酶解法提取黃秋葵SDF的單因素實驗

2.1.1 料液比對黃秋葵SDF得率的影響 圖1中,隨著料液比的增加,黃秋葵SDF得率先增加而后趨于穩定。在料液比為1∶25 g/mL時,SDF得率最高,為7.95%。適當的料液比可以使酶與底物充分反應,從而影響SDF的得率[20],在一定范圍內SDF的得率隨料液比的增大而升高;當酶和底物已經充分接觸,料液比繼續增加，得率變化不大。因此,綜合考慮提取效率和成本,較為適宜的料液比為1∶25 g/mL。

圖1 料液比對黃秋葵可溶性膳食纖維得率的影響

2.1.2 加酶量對黃秋葵SDF得率的影響 由圖2可知,當復合酶的添加量從0.5%增加至2.0%時,黃秋葵SDF得率不斷升高,當添加量為2.0%時,增加至8.88%,表明越來越多的酶同底物結合,充分發生反應。隨著加酶量的繼續增加,SDF的得率有所下降,SDF得率下降的原因可能是過量的復合酶繼續作用于可溶性膳食纖維,導致產物減少[21]。因此加酶量以2.0%為宜。

圖2 加酶量對黃秋葵可溶性膳食纖維得率的影響

2.1.3 酶解時間對黃秋葵SDF得率的影響 由圖3可知,酶解時間在20～60 min時,SDF得率上升,在酶解時間為60 min時,達到最大,為8.22%;酶解時間繼續增加,SDF得率呈下降趨勢。起初隨著酶解時間的增加,酶和底物充分反應,但當酶解時間過長時,酶的活性受外界因素影響而下降,影響提取的效率;另一方面酶水解了可溶性膳食纖維,造成產量的下降[21]。因此適宜的酶解時間為60 min。

圖3 酶解時間對黃秋葵可溶性膳食纖維得率的影響

2.1.4 酶解溫度對黃秋葵SDF得率的影響 由圖4可知,在40～60 ℃時,SDF得率隨酶解溫度的升高而增加;在酶解溫度為60 ℃時,SDF得率達到峰值,為8.88%。溫度會直接影響酶分子的活性,適宜的溫度可以使酶的活性最大程度地發揮;當溫度過高時,酶的活性大大損失,導致提取效率降低[22]。因此,較為適宜的酶解溫度為60 ℃。

圖4 酶解溫度對黃秋葵可溶性膳食纖維得率的影響

2.2 酶解法提取黃秋葵SDF的響應面優化試驗

2.2.1 回歸模型的構建及方差分析 酶解法提取黃秋葵SDF的響應面試驗設計方案見表1,按照方案中的工藝條件提取黃秋葵SDF,得到的試驗結果如表2所示。使用Design Expert 10.0對試驗數據進行擬合,得到二次多項式回歸方程為:

表1 響應面試驗因素水平

表2 響應面試驗設計方案與結果

Y=10.54 - 0.17A-0.65B-0.42C+0.50D+0.062AB+0.062AC+0.045AD-0.030BC+0.0075BD+0.26CD-0.89A2-0.98B2-0.60C2- 0.79D2

通過分析變量的P值來反應其對響應值的影響程度,P值越小,說明該變量對響應值的影響越顯著。由表3可知,加酶量(B)、酶解時間(C)和酶解溫度(D)對黃秋葵SDF得率的影響均極顯著(P<0.01),料液比(A)對黃秋葵SDF得率的影響不顯著(P>0.05)。通過對比表3中的F值可以看出,混合酶添加量對黃秋葵SDF提取效率的影響最大,酶解溫度、酶解時間次之,料液比影響相對較小。此外,二次項A2、B2、C2、D2對黃秋葵SDF得率的影響均極顯著(P<0.01),各因素間的兩兩交互作用對黃秋葵SDF得率的影響均不顯著(P>0.05)。

2.2.2 響應面分析 響應面圖是描繪了當其它因素水平不變時,兩個因素的水平發生變化對響應值所產生的影響情況的圖形,如圖5所示。

由圖5a可知,在料液比為1∶22～1∶26 g/mL,加酶量為1.7%～1.9%時,SDF得率有極大值。當加酶量和酶解溫度固定,料液比和酶解時間對得率的影響如圖5b所示,隨著料液比或酶解時間的增加,黃秋葵中SDF的提取效率均呈現先上升后下降的趨勢。在圖5e中,隨著加酶量或酶解溫度的增加,黃秋葵中SDF的得率先上升后下降。由圖5f可知,在酶解時間為50～60 min,酶解溫度為60～65 ℃時,黃秋葵SDF的得率有極大值。圖5中酶解時間(C)和酶解溫度(D)交互作用的響應面曲線較陡峭,對響應值影響最大;其它交互作用對應的響應面曲面較平緩,表明對響應值無顯著影響,同表3的方差分析結果一致。

圖5 酶解法提取黃秋葵SDF的兩因素交互作用響應面圖

表3 響應面試驗回歸模型的方差分析

在此模型的基礎上,使用軟件預測酶解法提取黃秋葵SDF的最佳工藝參數為料液比1∶24.43 g/mL、加酶量1.83%、酶解時間54.21 min、酶解溫度62.64 ℃,該條件下得到黃秋葵SDF得率的最大預測值為10.78%。

2.2.3 優化結果與驗證 考慮實際情況,將工藝參數調整為:料液比1∶24 g/mL、加酶量1.8%、酶解時間54 min、酶解溫度62 ℃。在此條件下進行驗證,設置3組平行實驗,實際提取得到黃秋葵SDF得率為10.94%±0.14%,相對誤差為1.48%,實驗值與預測值之間的差異不顯著(P>0.05),證明模型預測結果準確,能夠可靠地反映提取過程中各因素對黃秋葵SDF得率的影響情況。

2.3 黃秋葵SDF的理化性質

持水力、膨脹力和持油力是膳食纖維的重要理化性質,能夠反映膳食纖維的品質。在最優提取工藝下提取得到的黃秋葵SDF的持水力、膨脹力、持油力測定結果如表4所示,并與幾種其它來源的SDF進行比較。

表4 幾種不同來源的可溶性膳食纖維的持水力、膨脹力和持油力

由表4可知,黃秋葵SDF的持水力為(5.61±0.25) g/g,高于米糠膳食纖維;黃秋葵SDF膨脹力為(3.35±0.13) mL/g,高于米糠膳食纖維;黃秋葵SDF的持油力為(4.88±0.55) g/g,高于米糠膳食纖維、錦橙皮渣膳食纖維和雷竹筍膳食纖維。表明優化提取后的黃秋葵SDF具有良好的持水力、膨脹力和持油力。黃秋葵SDF的持油力來自于其表面暴露出的親油基團,膳食纖維對油脂的吸附作用可以對腸道起到保護作用。研究表明[26],黃秋葵SDF的持水力可以增加糞便的含水量,而膨脹性使其在溶于水后體積膨脹,同樣具有促進排便的作用。由圖6可知,黃秋葵SDF在100×倍數下呈現大小不一、排布緊密的粒狀,顆粒形狀較為清晰,結構較為完整;原料黃秋葵粉在100×倍數下呈碎塊化,為不均勻分布的顆粒、片狀物和棒狀物,形狀不規則、排列松散。未經處理的黃秋葵粉表面含有較多的淀粉和蛋白質,在5000×倍數下可觀察到其表面較為光滑;黃秋葵SDF在5000×倍數下可觀察到片狀結構,符合膳食纖維的一般形態,表面較提取前的黃秋葵粉更為粗糙,說明提取充分除去了淀粉、蛋白質[27]。觀察黃秋葵SDF的微觀結構,其表面分布有許多小孔,使其具有良好的持水性和吸附特性。因此若對黃秋葵SDF進行進一步的超聲或超微粉碎處理,可能會打破其片狀結構,使蜂窩狀小孔充分暴露,比表面積增加,實現對吸附性等功能特性的改良。

2.4 黃秋葵SDF的掃描電鏡結果

圖6(a1)、(b1)為放大100倍的黃秋葵SDF和黃秋葵粉的掃描電鏡圖,圖6(a2)、(b2)為放大5000倍的黃秋葵SDF和黃秋葵粉的掃描電鏡圖。

圖6 黃秋葵SDF與黃秋葵粉的掃描電鏡圖

2.5 傅里葉紅外光譜分析

使用傅里葉變換紅外(fourier transform infrared,FTIR)光譜儀,對黃秋葵SDF和黃秋葵粉進行掃描分析,得到相應的紅外光譜,如圖7所示。通過分析黃秋葵SDF的紅外光譜中吸收峰的位置與強度,可以反映SDF中存在的某些化學基團和結構。比較黃秋葵粉和黃秋葵SDF的吸收峰位置與形狀,可以得到提取前后混合物的組成變化情況。

圖7 黃秋葵粉與黃秋葵SDF的傅里葉紅外光譜圖

由圖7可知,黃秋葵SDF在3250 cm-1處有寬而強的吸收峰,此吸收峰由O-H伸縮振動引起,表明秋葵SDF中含有較多羥基,形成了締合狀態的氫鍵。在2960 cm-1處呈現弱峰,此吸收峰由糖類中的-CH3或-CH2-上的C-H伸縮振動引起。在1630 cm-1處的吸收峰由C=O伸縮振動引起,是羧基或醛基的特征峰,說明黃秋葵SDF中含有糖醛酸。在1400 cm-1處的吸收峰由C-H彎曲振動引起。在1090 cm-1處出現強吸收峰,此峰由C-O伸縮振動或O-H變角振動引起,說明黃秋葵SDF中存在糖環C-O-C或C-O-H結構。整體來看,黃秋葵SDF的紅外圖譜符合多糖類物質的典型特征[28]。

原料黃秋葵粉與黃秋葵SDF光譜的吸收峰位置大致相似,而黃秋葵SDF在892 cm-1處出現了新的吸收峰,該峰是β-吡喃糖的特征吸收峰,由C-H變角振動引起,說明黃秋葵SDF中存在β-吡喃糖。該吸收峰可能是在提取過程中由淀粉水解形成的。

2.6 X射線衍射分析

通過對黃秋葵SDF和黃秋葵粉進行X射線衍射(X-ray diffraction,XRD),分析圖譜可以推斷材料的晶體結構。通過比較黃秋葵粉和黃秋葵SDF的XRD圖譜,可以探究提取過程對SDF晶體的結構、序列和尺寸的影響。

分析黃秋葵SDF的XRD圖譜,如圖8A所示,可以看出:黃秋葵SDF在掃描角度2θ為22°處出現明顯的結晶衍射峰,在31°處有較弱的結晶衍射峰,符合纖維素Ⅰ晶型的特征,說明黃秋葵SDF為結晶區和無定形區共同存在的狀態[29]。比較黃秋葵SDF與黃秋葵粉的XRD圖譜,發現在提取前后的圖線形狀及出峰位置沒有明顯改變,混合物的晶體結構變化不大,說明提取過程對SDF的結晶區沒有造成明顯的破壞。比較縱坐標可以得知,黃秋葵SDF與提取前相比,峰強度下降,而且22°附近的主衍射峰變寬,這可能是由于SDF中部分晶體的序列和尺寸發生了改變。研究表明[30],膳食纖維的結晶區暴露,表現為衍射峰強度的減小,可以使膳食纖維的持水性、溶脹性等特性增強,進而使膳食纖維的一些生理功能得到改善。

圖8 黃秋葵粉與黃秋葵SDF的X射線衍射圖譜

3 結論

復合酶法提取黃秋葵SDF的最優條件為:料液比1∶24 g/mL、加酶量1.8%、酶解時間54 min、酶解溫度62 ℃,該條件下得到黃秋葵SDF的得率為10.94%。黃秋葵SDF的持水力為(5.61±0.25) g/g,膨脹力為(3.35±0.13) mL/g,持油力為(4.88±0.55) g/g,同其它來源膳食纖維的對比表明,黃秋葵SDF具有良好的理化特性,具有成為相關保健食品原料的潛力。黃秋葵SDF的微觀結構呈現膳食纖維類物質常見的片狀結構,其表面粗糙且分布有許多小孔;黃秋葵SDF的紅外光譜符合膳食纖維類物質的典型特征,含有較多締合狀態的氫鍵,并且存在糖醛酸和β-吡喃糖;黃秋葵SDF的XRD圖譜符合纖維素Ⅰ晶型的特征,在提取前后黃秋葵SDF的晶體序列和尺寸發生了改變。