蛋白質工程改造磷脂酶D提高磷脂酰絲氨酸產量

馮小娜,齊 娜,宋 偉,劉 佳,劉立明,吳 靜,*

(1.江南大學藥學院,江蘇無錫 214122;2.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)是唯一一種能夠調控細胞膜關鍵蛋白功能狀態的磷脂,對細胞代謝過程有重要的調節作用[1-2],廣泛應用于治療腦萎縮、兒童多動癥、老年癡呆癥[3-4]、修復大腦損傷[5]、恢復腦疲勞、緩解抑郁[6-7]。由于自然界中天然PS含量稀少[8-9],且提取工藝繁雜,難以滿足人們日益增長的需求,因此,開發環境友好、安全性高的磷脂酰絲氨酸生產方法,對進一步擴大磷脂酰絲氨酸應用范圍、改善人民身體健康具有重要意義。

PS的制備方法分為提取法和生物酶法[10-11]。提取法是以動物肝臟、腦或大豆等植物種子為原料,通過使用大量有機溶劑萃取制得,成本昂貴且工藝復雜,難以大規模工業化生產[12]。生物酶法以磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine,PC)和L-絲氨酸(L-serine)作為反應底物,在磷脂酶D(Phospholipase D,PLD)或磷脂酰絲氨酸合酶(Phosphatidylserine synthase,PSS)的催化作用下,發生轉磷脂酰基反應生成PS[13]。這一技術路線具有反應條件溫和、操作步驟簡單、環境污染小、產品安全性高等優點[14]。

磷脂酶(Phospholipase D,EC 3.1.4.4,PLD)廣泛分布于動物肝臟、植物根葉和微生物中[15]。PLD既能發生水解反應,水解磷脂生成磷脂酸,也能發生轉磷脂酰反應,催化羥基化合物(L-serine、甘油、乙醇胺、肌醇)結合到磷脂酰基上,形成新的磷脂[16]。其中轉磷脂酰作用更加重要,可以合成稀有磷脂如PS等[17]。然而,野生型PLD的轉磷脂酰活性較低,造成產品轉化效率不高,難以滿足工業化應用的需求。對酶分子進行蛋白質功能改造能有效提高催化活性、擴大底物范圍和改善酶穩定性[18],但有關蛋白質工程改造PLD提高PS產量的研究較少。Ogino等[19]證明輪枝鏈霉菌PLD中的保守甘氨酸-甘氨酸(GG)和甘氨酸-絲氨酸(GS)基序,特別是絲氨酸殘基對轉磷脂酰化活性至關重要,突變體G215S、G216S和G216S/S489G的轉磷脂酰化活性增強9～27倍。

針對這一現狀,本文將不同來源磷脂酶D在大腸桿菌中在進行異源表達,篩選出最佳來源的PLD并進行同源建模,基于結構分析催化通道及活性口袋,對其進行蛋白質工程改造,從而獲得磷脂酰絲氨酸(PS)產量提高的突變體,進一步對產量提高的機制進行闡釋,并將最佳突變體在3 L規模轉化體系中進行應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磷脂酶D目的基因來源菌株:StreptomycesghanaensisCGMCC 4.1967、StreptomyceskatraeCGMCC 4.1914、StreptomycesmobaraensisCGMCC 4.1719、AcinetobacterradioresistensCGMCC 1.15256、AcinetobactervenetianusACCC 19918、ThalassomonasactiniarumCGMCC 1.12876、StreptomycesgriseofuscusACCC 41181 購買自中國普通微生物菌種保藏中心CGMCC/中國農業微生物菌種保藏中心ACCC;E.coliJM109、E.coliBL21(DE3)、載體pET-28a質粒 均由作者所在實驗室保藏;Taq DNA聚合酶、限制性內切酶、T4 DNA Ligase、DNA Marker、Solution I、DpnI Takara公司;細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)股份公司;SanPrep柱式PCR產物膠回收試劑盒、質粒小量抽提試劑盒、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、卡那霉素 生工生物工程(上海)股份有限公司;標品磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酸 美國Sigma-Aldrich公司;胰蛋白胨、酵母粉 英國OXIOD公司;其他試劑 均為國產分析純,購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

ZQZY-CS9搖床 上海知楚儀器公司;VS-1300L超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;164-5050核酸電泳儀 美國Bio·Rad公司;320-S型臺式精密pH計 瑞士METTLER公司;Agilent 1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司;SpetraMax M3多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司;UV-2450型紫外-可見分光光度計 上海棱光技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PLD的異源表達及重組菌株的發酵培養 提取7種不同來源菌株(Streptomycesghanaensi、Streptomyceskatrae、Streptomycesmobaraensi、Acinetobacterradioresistens、Acinetobactervenetianus、Thalassomonasactiniarum、Streptomycesgriseofuscus)的基因組DNA,以其為模板,利用PCR擴增得到PLD的目的基因。將以上片段與T載連接并導入E.coliJM109(DE3)中,提取質粒后與pET-28a(+)的質粒均進行雙酶切,酶切產物連接后導入E.coliBL21(DE3)中。

將以上7種大腸桿菌重組菌株接種于含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養基中,37 ℃、200 r/min振蕩培養12 h,按照2%的接種體積分數轉接于100 mL含卡那霉素抗性的TB培養基中,37 ℃、200 r/min振蕩培養至OD600為0.6～0.8時,添加IPTG至其終濃度為1.0 mmol/L,25 ℃誘導培養12 h。4 ℃、6000 r/min條件下離心獲得的菌體即為全細胞催化劑,按照1.2.2和1.2.8方法測定7種重組菌株對底物磷脂酰膽堿的轉化能力及酶活。

1.2.2 兩相體系轉化PC和L-serine 以野生型PLD作為全細胞催化劑,使用雙相體系制備PS。有機相使用綠色溶劑環戊基甲醚、水相、有機相的體積比為1∶3、L-serine和PC的底物摩爾比為5∶1,其中底物PC的添加量為76 g·L-1，反應溫度為40 ℃，轉化時間為4 h。轉化反應得到的磷脂產品利用高效液相色譜法(HPLC)進行檢測,具體見方法1.2.9。

1.2.3 磷脂酶D的同源建模及分子對接 利用SWISS-MODEL在線網站(https://swissmodel. expasy. org/)搜索與Streptomyceskatrae菌株磷脂酶D的蛋白序列一致性較高的蛋白晶體結構,運用MODELLER9.11(http://salilab.org/modeller)程序對該蛋白晶體進行同源建模,并采用蛋白分子可視化軟件PyMol(http://pymol.org)對模擬的磷脂酶D蛋白三級結構進行分析。

使用ChemSpider在線網站(http://www. chemspider. com/)下載配體PC、L-serine和H2O的3D結構,并利用分子對接軟件Auto Dock進行剛性對接。將配體L-serine和PC對接入復合物PLD-PC、PLD-L-serine,獲得PLD-PC-L-serine、PLD-L-serine-PC兩種對接結果,將配體H2O對接入復合物PLD-L-serine獲得第三種對接結果PLD-L-serine-H2O。

1.2.4 PLD催化通道及催化腔體積模擬分析 利用Caver Analyst軟件對SkPLD的催化通道進行模擬分析[20],軟件參數設置為probe_radius 0.7、shell_depth 4.0、shell_radius 6.0;計算催化腔體積的參數設置為Pockets Large probe 4.0、Residues included His 192、His492。

1.2.5 突變體菌株的構建 將位點Asp214、Thr362、Gly398、Val400、Ser402、Tyr405突變成Ala、位點Asn209、Asp224、Gln357、Asp370、Gln405、Lys474、Lys478、Asn479、Tyr481依次突變成Trp、Phe、Val、Leu、Ile、Ala、Met。以重組質粒pET28a-SkPLD為模板進行全質粒PCR。反應體系包括PrimerStar酶0.5 μL、模板DNA 1 μL、上下游引物各1 μL、10×PS buffer 10 μL、dNTP 4 μL、DMSO 5 μL,加水至終體積50 μL。PCR反應條件:94 ℃預變性3 min;98 ℃變性10 s;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸1 min 40 s(29個循環);72 ℃延伸5 min。PCR產物經DpnI消化后轉化至E.coliBL21(DE3)感受態細胞,涂布于含卡那霉素的LB平板上。挑取陽性克隆子送至測序,測序正確的即為構建的突變體菌株。

1.2.6 突變體的動力學研究 按照1.2.2的最佳轉化條件,將磷脂酶D與底物磷脂酰膽堿(PC)反應,測定PLD酶活,根據米氏方程,使用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法,計算出磷脂酶D的動力學參數。

1.2.7 規模化制備PS 將磷脂酰絲氨酸的制備規模放大到3 L的發酵罐上進行,轉化體系設置為:76 g·L-1的PC、30 g·L-1的濕菌體。控制條件為:pH5.5、溫度25 ℃、通氣1 vvm、攪拌轉速500 r/min。

1.2.8 酶活測定方法 磷脂酶D的酶活性測定參見文獻,并略作修改[21]。取13.5 μL的10 mmol/L的卵磷脂底物溶液和3.5 μL的100 mmol/L CaCl2溶液,用HCl調節pH至8.0,加入10 mL酶溶液,于50 ℃反應10 min。100 ℃反應1 min后,立即加入1 U膽堿氧化酶、1 U辣根過氧化物酶、70 μL顯色液(0.24 mg/mL 4-氨基安替比林、0.16 mg/mL苯酚溶于100 mmol/L Tris-HCl),于37 ℃下反應10 min。在500 nm下檢測反應液的吸光度。

酶活力定義為:以卵磷脂為底物,37 ℃條件下,每分鐘產生1 μmol膽堿所需的酶量定義為一個酶活力單位,記為U/mL。

1.2.9 HPLC法檢測磷脂 HPLC色譜條件:色譜柱為LiChrospher? 100 DIOL(5 μm,250 mm×4 mm),以正己烷∶異丙醇∶乙酸-乙酸鈉(8∶8∶1,v/v/v)為流動相,樣品用0.22 μm膜過濾,柱溫為30 ℃,紫外檢測波長為210 nm,進樣量為20 μL,流速為1 mL/min,利用色譜圖中峰面積和標準曲線,計算樣品中磷脂酰膽堿PC、磷脂酰絲氨酸PS和磷脂酸PA的轉化率[22]。轉化率計算如下:

式中:mPS/PA表示PS、PA的質量,g;mPC表示PC的初始質量,g;742、398和758分別表示PS、PA和PC的相對分子質量。

1.3 數據處理

所有試驗均重復三次。利用Original 2016軟件進行數據作圖分析。利用可視化軟件PyMol對模擬的磷脂酶D蛋白三級結構進行作圖分析。

2 結果與討論

2.1 親本酶及反應瓶頸

首先以Streptomycessp. PMF的PLD序列在NCBI上進行BLAST比對,選擇相似性在30%～70%的7種來源不同的PLD,將其異源表達于E.coliBL21(DE3)中,具體見方法1.2.1。將7種重組菌株以磷脂酰膽堿(PC)和L-serine為底物,篩選到4種具有轉磷脂酰活性的PLD,分別是來源于Streptomycesghanaensis、Streptomyceskatrae、Streptomycesmobaraensis、Acinetobacterradioresistens,結果列于表1。其中Streptomyceskatrae來源的PLD酶活為18.6 U/mL、轉化率為31.3%。因此,后續研究中選擇Streptomyceskatrae的PLD作為親本酶用于蛋白質改造。

表1 不同來源PLD的酶活性和轉化率

為了確定提高PLD催化效率的限制因素,按照1.2.2的轉化條件,以野生型SkPLD作為全細胞催化劑,使用雙相體系制備PS。野生型SkPLD轉磷脂酰反應的轉化率為34.8%,PS產量為26.5 g·L-1;水解反應的轉化率為31.2%,生成大量的副產物磷脂酸(PA),且仍有33.9%的底物PC未反應。因此,確定磷脂酶D的反應瓶頸主要包括兩個方面:轉磷脂酰反應的催化效率低(<35%);水解反應轉化率過高(>30%),形成大量副產物PA。

2.2 磷脂酶D的蛋白質改造

2.2.1 磷脂酶D的同源建模及分子對接 為了更準確地識別影響PLD結合大體積磷脂底物的關鍵殘基,利用Swiss-Model在線軟件,選擇與SkPLD蛋白序列相似性為53%的來源于Streptomycessp. PMF的磷脂酶D蛋白晶體結構(PDB編號:1F01)進行同源建模,野生型磷脂酶D結構如圖1a。“HxKxxxxD(HKD)”結構域是PLD超家族的結構特征,以單拷貝或雙拷貝的形式存在于一級結構中,且HKD結構域中的組氨酸殘基在催化中發揮重要作用。SkPLD具有兩個HKD結構域,關鍵催化殘基為192位His和462位His。

圖1 SkPLD的同源建模及分子對接

研究表明雙底物(PC和L-serine)和PLD的結合順序對于構建準確的反應模型有重要作用[23],其中PC與PLD-Ser的相互作用是唯一的結合途徑。將底物PC對接入PLD-Ser復合物的活性口袋中,如圖1b所示,底物磷脂酰膽堿的兩條長脂肪酸鏈暴露在蛋白表面,這一結果表明,由于底物通道狹小或存在位阻效應,導致底物結合腔無法完全容納體積較大的磷脂底物PC。

磷脂酶D催化合成PS的機理是[24]:His192作為親核試劑攻擊底物PC的磷原子,形成帶負電荷的五價磷過渡態;然后,His462釋放一個質子,提供氫以產生膽堿和磷脂酰基-酶中間體;接著,第二底物L-serine進行去質子化(脫去氫),活化的L-serine作為攻擊磷脂酰基-酶中間體中磷原子的第二親核體,從而產生磷脂酰絲氨酸(PS)。根據催化機理分析比較His462與底物L-serine和H2O的催化距離,如圖1c所示,His462 N原子與L-serine O原子的催化距離d1為5.8 ?、His462 N原子與H2O O原子的催化距離d2為4.1 ?,d1>d2,且相較于L-serine,PLD與H2O的結合能(-5.19 kcal/mol)更高,說明PLD更易與水分子結合,從而發生水解反應。

因此,如要提高SkPLD的催化效率,需要從兩個方向對PLD進行改造:擴大底物催化通道,降低底物進入口袋的位阻效應,使其能夠容納大體積底物PC,提高PLD的轉磷脂酰活性;提高PLD活性位點His462與L-serine的親和力,降低水解反應。

2.2.2 磷脂酶D的蛋白質改造 按照方法1.2.4利用Caver Analyst軟件對SkPLD的催化通道進行模擬分析,發現SkPLD有3個催化通道,分別為Tun_a、Tun_b、Tun_c,如圖2a～c所示,其中Tun_a的通道長度為13.55 ?,無瓶頸半徑及瓶頸氨基酸殘基;Tun_b的通道長度為18.96 ?,瓶頸半徑為2.03 ?,瓶頸氨基酸殘基是Thr362、Gly398、Val400;Tun_c的通道長度為16.56 ?,瓶頸半徑為1.83 ?,瓶頸氨基酸殘基是Asp214、Ser402、Tyr405。因為瓶頸半徑大小會直接影響底物分子進入活性腔的難易程度,半徑越大,底物分子越容易進入活性腔[25]。因此通過引入小體積氨基酸Ala來擴大瓶頸半徑,共構建6個單突變體(T362A、G398A、V400A、D214A、S402A、Y405A)進行轉化,發現單突變體SkPLDY405A的突變效果最佳,轉化率達到47.2%,PS產量為35.9 g·L-1。

由于底物PC的磷脂頭部為親水性,而尾部的長脂肪酸鏈為疏水性,磷脂酶D結合區域的親疏水性會對底物進入活性口袋造成位阻效應。利用LigPlot+軟件分析底物PC在酶催化口袋的氫鍵相互作用及疏水作用,如圖2d所示,發現配體PC的脂肪酸鏈與Asn209、Asp224、Gln357、Gln405、Asn479、Tyr481發生氫鍵相互作用。通過引入疏水性氨基酸(Trp、Phe、Val、Leu、Ile、Ala、Met),構建了42個單突變體,其中單突變體SkPLDQ407G轉化效果最佳,其轉化率達到45.1%,PS產量為34.3 g·L-1。

圖2 SkPLD的催化通道及配體PC周圍的相互作用

為了提高PLD與L-serine的結合程度,將配體H2O對接入磷脂酶D的活性口袋,選擇5 ?范圍內的5個極性氨基酸殘基(Asp370、Lys474、Lys478、Asn479、Tyr481),通過引入疏水性氨基酸來降低PLD與H2O的氫鍵相互作用,構建35個單突變體。其中獲得兩個有益單突變體SkPLDD370P和SkPLDK478P,PS轉化率分別為41.7%、42.2%,PS產量分別為31.7、32.1 g·L-1。對其進行組合突變后構建雙突變體SkPLDD370P/K478P,其PS轉化率提高到50.8%,PS產量為38.6 g·L-1。

表2 WT及各突變體的PS、PA產量及PC殘留量

將Y405A、Q407G、D370P、K478P四個有益突變位點進行組合突變,獲得最佳四突變體SkPLDY405A/Q407G/D370P/K478P,其PS轉化率達到55.6%,PS產量42.3 g·L-1,分別比WT提高59.8%、59.6%。測定WT與突變體SkPLDY405A、SkPLDQ407G、SkPLDD370P、SkPLDK478P、SkPLDD370P/K478P、SkPLDY405A/Q407G/D370P/K478P的PA生成量及PC殘留量,WT的PC殘留量為25.8 g·L-1、PA生成量為23.7 g·L-1,四突變體SkPLDY405A/Q407G/D370P/K478P的PC殘留量為15.4 g·L-1,相較于WT降低40.3%,副產物PA生成量為18.3 g·L-1,相較于WT降低22.8%。

2.3 突變體評價及機理解析

以磷脂酰膽堿為底物測定磷脂酶D野生型及其突變體的動力學參數,結果見表3。野生型SkPLD和四突變體SkPLDY405A/Q407G/D370P/K478P的Km值分別為12.36和10.95 mmol/L,kcat分別為9.76和16.75 s-1。四突變體SkPLDY405A/Q407G/D370P/K478P的kcat/Km[1.53(mmol/L)-1s-1]比WT[0.79(mmol/L)-1s-1]提高93.7%,總轉換數(TTN)(20100)是WT(12000)的1.68倍。

表3 WT及突變體的動力學參數

為了解析催化效率提高的原因,利用CAVER Analyst對最佳四突變體的催化腔體積進行測定。如圖3a所示,WT催化腔體積為546.6 ?3,四突變體SkPLDD370P/Y405A/Q407G/K478P的催化腔體積擴大到718.6 ?3,這一結果表明將位于底物通道的Y405、Q407突變成小體積的氨基酸Ala、Gly能顯著擴大磷脂酶D催化口袋,從而提高PLD對大體積底物PC的催化活性。另一方面,四突變體SkPLDD370PY405A/Q407G/K478PHis462 N原子與L-serine O原子之間的距離(d1)比WT縮短了0.6 ?,與H2O的O原子之間的距離(d2)增加了0.8 ?,如圖3c所示。此外,相較于WT,SkPLDD370P/Y405A/Q407G/K478P與H2O的結合能減小到5.02 kcal/mol、與L-serine的結合能提高到-4.76 kcal/mol,說明位于活性位點His462附近的D370、K478突變成疏水性氨基酸Pro能夠提高PLD與L-sreine的結合力。

圖3 D370P、Y405A、Q407G、K478P的空間分布及催化腔變化

2.4 制備級規模轉化

在最佳的轉化反應條件下,將制備PS的規模放大到3 L體系進行轉化。以SkPLDD370P/Y405A/Q407G/K478P作為全細胞催化劑,反應4 h后,PS產量為50.4 g·L-1,轉化率達到66.3%,時空產率為12.6 g/L/h,為工業化生產磷脂酰絲氨酸奠定了基礎。

圖4 3L發酵罐上SkPLDD370P/Y405A/Q407G/K478P發酵產PS的過程曲線

3 結論

本研究將來源于Streptomyceskatrae的PLD過量表達于E.coli中并構建了高效催化合成PS的菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a-SkPLD,限制其轉化生產PS產量進一步提高的瓶頸在于:較低的轉磷脂酰反應的催化效率和較高的水解反應速率。在對SkPLD蛋白結構進行詳盡解析后借助理性蛋白質工程策略擴大PLD底物催化通道,降低大體積底物PC進入底物口袋的位阻效應,提高PLD轉磷脂酰活性;同時通過提高活性位點His462與L-serine的親和力,降低水解反應速率,獲得4個有益突變體(Y405A、Q407G、D370P、K478P),組合突變后獲得的最佳四突變體SkPLDY405A/Q407G/D370P/K478P的轉化率達到55.6%、PS產量為42.3 g·L-1、kcat/Km為1.53 (mmol/L)-1s-1,分別比WT提高59.8%、59.6%、93.7%。轉化率和產量進一步提高的原因在于,突變體催化腔體積增加到718.6 ?3,且活性位點與L-serine催化距離縮短0.6 ?、與競爭底物H2O的催化距離增加0.8 ?。在3 L規模轉化體系中,最佳突變體的PS產量為50.4 g·L-1、轉化率達到66.3%,時空產率為12.6 g/L/h。