兩種方法提取的雞肺膠原蛋白性質及保濕性研究

楊 恒,陳銀基,鄒 燁,王道營,徐為民,胡慧敏,陳 晨

(1.南京財經大學食品科學與工程學院,江蘇南京 210023;2.江蘇省農業科學院農產品加工所,江蘇南京 210014)

膠原蛋白是一種透明的白色無支鏈纖維結構蛋白[1-2],由動物細胞的細胞基質合成。它在動物體內占蛋白質總量的25%～30%,廣泛存在于動物組織中,如皮膚、肌膜、韌帶和血管等,主要決定結締組織的韌性,起著保護機體、支撐器官的作用[3-5],膠原蛋白被廣泛應用于醫學材料、皮革工業、化妝品、食品工業等[6]。

我國是一個畜牧業大國,畜禽生產總量居世界前列[7]。2018年全球肉雞生產量達到9250萬噸,我國肉雞擺脫了H7N9疫情的影響,生產形勢回暖,產量達到1170.0萬噸,僅次于美國、巴西和歐盟。在國際肉雞生產呈現持續增長態勢的情況下,肉雞副產物的產量也逐年上升[8]。雞血、雞糞、雞毛、雞骨等肉雞副產物均已開始被加工利用,可制備成食品添加劑、動物飼料或復合材料,但國內外對雞肺利用和加工的相關報道卻很少,利用率很低,大量的丟棄不僅造成資源浪費,還會污染環境、傳播疾病、危害養禽業[9]。通過前期預試驗,酸法提取的膠原蛋白得率占除雜后凍干雞肺(干重)的8.39%,表明雞肺中含有豐富的膠原蛋白,雞肺具有較高的開發利用價值。但是,酸法提取有著工藝耗時過長等缺陷,還需不斷改進和完善。超聲波輔助提取法是一種極具潛力的食品加工技術,具有高效節能、綠色環保等特點[10],常被應用在天然產物的提取中[11]。

本文以新鮮雞肺為研究對象,乙酸為提取劑,采用傳統酸法和超聲輔助酸法提取膠原蛋白,并對其性質進行比較,探討超聲波輔助酸法提取雞肺膠原蛋白的可行性和優勢,為進一步促進雞肺的綜合利用及其膠原蛋白開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞肺 江蘇立華牧業股份有限公司;羥脯氨酸 上海源葉生物科技有限公司;纖維素透析袋(500～1000) 上海源葉生物科技有限公司;SDS-PAGE上樣緩沖液 南京沃博生物科技有限公司;蛋白定量(TP)測定試劑盒 南京建成科技有限公司;異丙醇、NaHCO3、乙酸、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、乙酸、乙酸鈉、氫氧化鈉、高氯酸、對二甲基氨基苯甲醛、異丙醇、氯胺T 均為國產分析純。

SCIENTZ-IID超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;奧豪斯ST20筆式酸度計 美國奧斯豪公司;JYL-D051九陽料理機 九陽股份有限公司;Gen5全波長酶標儀 美國伯騰儀器有限公司;SYC-6水浴搖床 上海新苗醫療器械制造有限公司;國華78-1磁力加熱攪拌器 常州國華電器有限公司;Centrifuge 5810R離心機 德國Eppendorf艾本德股份公司;PTX-FA210S電子天平 福州華志科學儀器有限公司;德國Christ實驗室型Alpha1-2LD plus凍干機 德國Christ公司;SHB-III循環水式多用真空泵 南京科爾儀器設備有限公司;EVO-LS10掃描電子顯微鏡 德國ZEISSE Oberkochen公司;UV-6100紫外分光光度儀 上海美普達儀器有限公司;Zetasizer Nano Zs90馬爾文激光粒度分析儀 英國Malvern儀器有限公司;L-8900高效氨基酸分析儀 日本Hitachi公司;Nicolet 200SXV傅里葉變換紅外光譜儀 美國Nicolet公司;Rigaku D/Max2500X射線衍射儀 日本理學公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雞肺膠原蛋白提取工藝流程及操作要點

1.2.1.1 工藝流程 新鮮雞肺→脫脂→去除非膠原成分→真空冷凍干燥(-40 ℃,48 h)→超聲輔助酸法提取或常規酸法提取→10000 r/min離心10 min取上清液→加入NaCl至溶液濃度為0.9 mol/L→10000 r/min離心10 min取沉淀→用0.5 mol/L乙酸溶解→在0.1 mol/L乙酸環境中透析2 d→真空冷凍干燥(-40 ℃,48 h)

1.2.1.2 操作要點 參照蔡盼盼[12]的方法處理雞肺。

雞肺脫脂:取一定量的新鮮雞肺,先用清水浸泡并剔除大體積脂肪塊,再沖洗三次除去表面雜質。勻漿后置于燒杯以料液比1∶9 (V/V)加入異丙醇溶液并充分攪拌,4 ℃下靜置24 h,然后10000 r/min離心10 min取沉淀,用蒸餾水沖洗至中性,充分瀝干后-18 ℃冷凍保存,備用。

去除雞肺中的非膠原蛋白成分:稱取脫脂雞肺80 g,用0.1 mol/L的NaHCO3溶液(1∶10,W/V)在20 ℃下連續磁力攪拌8 h以去除雜質和色素(非膠原成分),取10000 r/min離心10 min后的沉淀物,用蒸餾水反復洗滌3次,充分瀝干后在-18 ℃冷凍保存,備用。

酸法提取:準確稱量凍干的除雜雞肺樣品1.0 g,以料液比1∶90 g/mL加入0.5 mol/L的乙酸溶液再置于水浴搖床中20 ℃下提取24 h。

超聲輔助酸法提取:準確稱量凍干的除雜雞肺樣品1.0 g,以料液比1∶90 g/mL加入0.5 mol/L的乙酸溶液,365 W超聲處理10 min,然后置于20 ℃水浴振蕩器中320 min。

1.2.2 雞肺膠原蛋白氨基酸組成分析 參照國標GB/T 5009.124-2003,將20 mg膠原蛋白樣品溶解于2 mL 6 mol/L HCl溶液中,水解在110 ℃條件下進行24 h,并用氨基酸自動分析儀測定水解產物。

1.2.3 紫外光譜掃描分析 用0.5 mol/L乙酸溶液溶解適量膠原蛋白樣品,10000 r/min離心20 min,取上清液掃描紫外吸收光譜。掃描范圍在190～400 nm,光譜間隔為1.0 nm。

1.2.4 SDS-PAGE分析 參照Matmaroh等[13]的方法。用12%的分離膠和5%的濃縮膠進行電泳。將20 μL樣品(用0.5 mol/L的乙酸溶解雞肺膠原蛋白樣品,料液比為5 mg/mL)與5 μL上樣緩沖液混合,沸水浴5 min,12000 r/min離心5 min,取20 μL處理后的樣品上樣。電泳先在80 V進行約20 min;然后在120 V進行約1.5 h。電泳結束后用考馬斯亮藍R-250染色20 min,然后用脫色液脫色至條帶可以清晰分辨為止。

1.2.5 傅里葉紅外光譜分析 參照GB/T 6040-2002的方法,用傅立葉變換紅外光譜儀掃描。將適量樣品和KBr混勻后研磨成粉末狀,取適量壓片后放入樣品室,用干燥KBr做背景掃描。掃描區間在500～4000 cm-1,分辨率設置為2 cm-1。

1.2.6 X-射線衍射分析 使用射線衍射儀測定,X-射線源是管電壓為30 kV 的Cu靶Kα射線,管電流為10 mA,設置λ=0.154 nm,掃描速度為0.06 °/s,掃描范圍在5～35 °(2θ)。

1.2.7 粒徑分布 用0.5 mol/L乙酸溶解蛋白樣品濃度至1.0 mg/mL,緩慢加入石英比色皿中,設置參數后用馬爾文激光粒度分析儀掃描。取3次連續測試的平均值作為膠原蛋白樣品的最終粒徑分布。

1.2.8 掃描電子顯微鏡(SEM) 將冷凍干燥后的樣品固定在載物臺上,經離子濺射噴金處理4 min后,在加速電壓為5.0 kV條件下,用掃描電子顯微鏡觀察不同放大倍數下膠原片的橫截面特征,并比較表面微觀結構異同。

1.2.9 溶解性 參照陳日春[14]的方法測定膠原蛋白的溶解性。

將凍干膠原蛋白樣品用0.5 mol/L乙酸配制成3 mg/mL的溶液,取8 mL至50 mL離心管中,用6 mol/L NaOH或6 mol/L HCl調節pH分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。加入蒸餾水至體積為10 mL,在4 ℃條件下振蕩30 min,10000 r/min離心15 min。用考馬斯亮藍法測定溶解蛋白質含量。

分別取5 mL 6 mg/mL的膠原蛋白溶液,再分別加入5 mL濃度為0、2%、4%、6%、8%、10%和12%的NaCl溶液,分散液在4 ℃振蕩30 min,10000 r/min離心15 min。用考馬斯亮藍法測定溶解蛋白質含量。

1.2.10 吸濕性和保濕性 參照季文靜等[15]的方法測定膠原蛋白的吸濕、保濕性。

吸濕性測定:準確稱取0.1 g凍干膠原蛋白于玻璃培養皿中,再置于相對濕度(RH)60%,溫度20 ℃的恒溫恒濕箱中。分別稱量放置2、4、6、8、10、12、24 h后樣品的質量。吸濕率的計算公式為:

式(1)

式中:Wo為樣品吸濕前質量(g);Wn為樣品吸濕后質量(g)。

保濕性測定:準確稱取0.1 g凍干膠原蛋白于玻璃培養皿中,加入10%的水,再置于相對濕度(RH)25%,溫度20 ℃的恒溫恒濕箱中。分別稱量放置2、4、6、8、10、12、24 h后樣品的質量。保濕率的計算公式為:

式(2)

式中:Ho為放置前水分質量(g);Hn為放置后水分質量(g)。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 雞肺膠原蛋白的氨基酸分析

根據表1氨基酸結果分析可知,兩種方法所得的膠原蛋白氨基酸組成基本相似。常規酸提的膠原蛋白中氨基酸總量為90.02%,超聲輔助酸提的膠原蛋白氨基酸總量為93.44%。必需氨基酸分別占總量的16.83%和19.36%。甘氨酸含量所占比例最大,分別占氨基酸總量的24.12%和23.93%。甘氨酸和膠原蛋白超螺旋結構的最終形成有密切的關系,使三股螺旋的α鏈緊密地結合在一起[16]。亞氨基酸由脯氨酸和羥脯氨酸組成,含量為19.74%和22.28%,對膠原的熱穩定性起重要作用。另外,丙氨酸、精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸含量較高,這些氨基酸對膠原蛋白的功能特性具有重要作用。蛋氨酸含量較少,不含有L-半胱氨酸和色氨酸,與盧昭[17]的研究結果相一致。

表1 常規提取和超聲輔助提取膠原蛋白氨基酸分析(%)

2.2 紫外光譜分析

膠原蛋白結構中含有在紫外區域吸收的發色團。UV光譜掃描結果如圖1所示,超聲輔助酸提膠原蛋白的最大吸收峰在224.9 nm處,酸提膠原蛋白的最大吸收峰在229.0 nm處。這主要歸因于膠原蛋白分子中的肽鍵C=O的n→π*躍遷,在220 nm左右通常具有強烈的紫外吸收[18]。蛋白質一般都含有Try、Tyr和Phe,它們分子中都含有共軛雙鍵,屬于敏感的發色基團。其中Try在280 nm波長處吸收峰最強,因此大多數蛋白質在280 nm處有較強的吸收峰[19]。而膠原蛋白結構比較特殊,幾乎不含有Try,因此可通過檢測280 nm波長處的吸光值來判斷膠原蛋白的純度[20]。在該圖中,超聲輔助酸提的膠原蛋白在280 nm處具有較弱的吸收峰,這與膠原的吸收特性相一致,而酸提的膠原蛋白在275.1 nm處有較小的吸收峰,這可能是由于分子內部仍含有Tyr殘基,存在著共軛雙鍵引起的。

圖1 雞肺膠原蛋白的紫外光譜圖

2.3 SDS-PAGE分析

由圖2可知,兩種方法提取的雞肺膠原蛋白均由140 kDa的α1鏈、125 kDa的α2鏈、較高分子量的少量γ鏈和β鏈組成,與氨基酸分析結果相一致。該肽鏈組成與膠原蛋白的肽鏈組成特征高度一致,說明所提取的蛋白質屬于膠原蛋白[21],與氨基酸分析結果相一致。而在α2鏈條帶下未發現其余明顯的條帶,說明所提取的膠原蛋白純度較高,蛋白構象穩定,基本結構保存較好,超聲輔助酸提沒有水解膠原蛋白成多肽和小分子膠原蛋白,與張強等[22]的研究結果相符。

圖2 雞肺膠原蛋白的SDS-PAGE圖

2.4 雞肺膠原蛋白的紅外光譜分析

天然膠原蛋白含有獨特的三螺旋構型,結果顯示雞肺膠原蛋白具有典型的膠原蛋白傅里葉變換紅外光譜特征吸收峰,即在酰胺A、B及Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ帶具有明顯的特征吸收[23]。在紅外光譜的酰胺A帶通常吸收范圍是3400～3440 cm-1,這主要是由于自由的N-H鍵伸縮振動引起,當N-H基團參與多肽中的氫鍵形成時,其波數會藍移,一般在3300 cm-1左右[24]。由圖3可知,酸提和超聲輔助酸提的膠原蛋白酰胺A帶的特征吸收分別為3274.06和3273.57 cm-1,特征吸收峰位置基本一致,兩種方法所提取的膠原蛋白中均存在氫鍵。酰胺I帶是由C=O伸縮振動引起,吸收峰一般不受肽鏈側基的影響,其振動頻率和膠原蛋白的有序程度相關,取決于肽鏈的構型,酰胺I帶對三螺旋結構的變化非常敏感[25]。酸提和超聲輔助酸提的膠原蛋白酰胺I帶的吸收峰為1644.02和1625.22 cm-1,符合通常的吸收波數1630～1680 cm-1。酰胺II帶是由于N-H彎曲振動和CN伸縮共振吸收引起,酸提和超聲輔助酸提的膠原蛋白酰胺II帶的吸收峰分別為1540.85和1532.65 cm-1,在膠原蛋白酰胺Ⅱ帶的吸收峰一般范圍1500～1600 cm-1之間。酸提和超聲輔助酸提的膠原蛋白在1239.04和1236.15 cm-1處出現了酰胺III帶的特征吸收,且在1251和1500 cm-1的酰胺II帶和酰胺III帶間又出現了吸收帶,也表明了樣品的螺旋結構保持較好[26]。紅外光譜分析結果表明所提取雞肺膠原蛋白的三股螺旋結構保持較好,在提取過程中未被破壞。

圖3 雞肺膠原蛋白的紅外光譜圖

2.5 雞肺膠原蛋白的X-射線衍射光譜

所提樣品膠原蛋白的X-射線衍射光譜如圖4所示,超聲輔助酸提和常規酸法提取的膠原蛋白均有三個衍射峰且吸收峰位置一致。第一個峰位置在7.6 °,該峰表明了膠原纖維分子鏈間的距離;第二個峰出現在22.3 °,該峰相對寬大,它是由于膠原蛋白分子內部復雜的結構層次而引起的漫散射所產生;第三個峰是一個尖且窄的峰,出現位置在31.5 °,該峰表示膠原蛋白分子三螺旋結構上相鄰氨基酸殘基之間的距離[27]。

圖4 雞肺膠原蛋白的X-射線衍射光譜

根據X-射線的波長(λ=0.154)和θ角,代入布拉格方程2dsinθ=λ計算出各個衍射峰所對應的d值。

由表2可知,酸提和超聲輔助酸提的雞肺膠原蛋白分子鏈間的距離分別為0.78和0.77 nm,相較比目魚纖維分子鏈間距略小[28],說明提取的雞肺膠原蛋白分子鏈間的范德華力和氫鍵作用較大,分子鏈間距離較小,排列較為緊湊。在膠原蛋白的三螺旋結構中,螺距為0.96 nm,每圈螺旋含3.3個氨基酸殘基,沿螺旋中心軸方向相鄰氨基酸殘基的間距為0.29 nm[29],計算結果得到第三個峰的d值0.30和0.29 nm與此相接近,也與胡子鯰魚皮酸溶性膠原蛋白和鱈魚酸溶性膠原蛋白測得的數據相似。以上結果說明超聲輔助酸提的雞肺膠原蛋白較好地保持了原有的螺旋結構。

表2 膠原蛋白的X-射線衍射峰對應d值

2.6 雞肺膠原蛋白的粒徑分布

圖5是常規酸提的雞肺膠原蛋白和超聲輔助酸提的雞肺膠原蛋白的粒徑分布圖,由圖5中可看出,超聲輔助酸提的膠原蛋白主要分布在295 nm左右,而常規酸提的膠原蛋白主要分布在340 nm左右。經過超聲處理后所提取的膠原蛋白的整體粒徑小于常規酸提的膠原蛋白。超聲波產生的機械效應和空化效應使膠原蛋白中的以氫鍵結合的大分子斷裂成小分子(肽鏈)[30]。小分子與大分子通過氫鍵作用重新結合,但整體粒徑變小。超聲輔助酸提的膠原蛋白在60 nm左右有小部分分布,可能是因為小分子肽鏈未能與大分子肽鏈形成氫鍵導致。說明超聲處理對膠原蛋白的結構有破壞氫鍵并改變膠原蛋白聚集形態的作用。

圖5 雞肺膠原蛋白的粒徑分布

2.7 雞肺膠原蛋白的掃描電鏡

膠原蛋白的顯微結構對實際應用有重要影響[31]。由圖6可知,超聲輔助酸提的雞肺膠原蛋白在掃描后呈現出三維立體空間結構,由分布規則且均勻的絲狀和薄片狀的纖維相互交聯而成。酸提的雞肺膠原蛋白較超聲輔助酸提的雞肺膠原蛋白表面更細膩光滑,存在較少的折疊褶皺現象,這可能是超聲處理有效地分散了蛋白質,使蛋白質結構變得疏松。但兩種方式提取的膠原蛋白均以片狀表面附著松散纖維狀分布,與馬鮫魚膠原的顯微結構類似[32],說明在提取過程中膠原蛋白的纖維結構得以保持。經超聲處理的膠原蛋白可能更容易被加工利用,在食品、化妝品、生物醫藥材料等方面有更開闊的前景。

圖6 雞肺膠原蛋白的掃描電鏡圖

2.8 膠原蛋白的溶解性

2.8.1 pH對膠原蛋白溶解度的影響 圖7表明了pH對膠原蛋白溶解度的影響。在酸性范圍內,雞肺膠原蛋白的溶解度較大,且在pH3附近達到最大值,隨著pH的繼續增加,膠原蛋白的溶解度開始下降,隨著pH的繼續增大,膠原蛋白的溶解度又開始增加?？傮w上膠原蛋白的溶解度隨著pH的增加有先升高后下降再回升的趨勢。膠原蛋白屬于兩性電解質,其溶解度的大小和等電點聯系緊密,膠原蛋白一般在pH6～9時具有等電點。在等電點附近,膠原蛋白所帶的凈電荷幾乎為零,分子間由于沒有靜電斥力的作用而發生聚集然后沉降,所以溶解度較小。當偏離等電點時,膠原蛋白帶有一定量的凈電荷,分子之間因為靜電斥力不易發生聚集和沉降,分散性較好,因此溶解度較大。圖中在pH3時蛋白質分子的殘基所帶凈電荷最多,因此膠原蛋白溶解度最大[33]。酸提雞肺膠原蛋白等電點為7,在此pH下溶解度最小;超聲輔助酸提的膠原蛋白等電點為6,在此pH6下溶解度最小。這可能是由于超聲波產生的空化效應和機械效應改變了蛋白質顆粒大小和氫鍵組成，從而影響了等電點的大小。

圖7 pH對膠原蛋白溶解度的影響

2.8.2 NaCl濃度對膠原蛋白溶解度的影響 兩種方法提取的膠原蛋白在不同濃度NaCl中的溶解性如圖8所示。NaCl濃度在0～2%時膠原蛋白的溶解度相對較高且保持穩定,僅有小范圍的浮動。當NaCl濃度繼續增加,酸提和超聲輔助酸提的膠原蛋白的溶解度均持續明顯下降。膠原蛋白在NaCl溶液中存在著鹽溶和鹽析作用,在不同濃度下出現的溶解度變化是兩者共同作用的結果。當NaCl濃度較低時,鹽離子能夠與膠原蛋白分子結合,使膠原分子表面所帶的正電荷增加,分子間斥力變大,膠原蛋白結構保持穩定,溶解度較大;當NaCl濃度較高時,強極性的鹽離子爭奪與膠原蛋白分子結合的水分子,破壞分子周圍的水化膜,使膠原脫水而析出,導致溶解度的降低[34]。超聲輔助酸提的膠原蛋白溶解度要略高于常規酸法提取的膠原蛋白,這可能是由于超聲效應使蛋白質顆粒變小,溶解度增大。

圖8 NaCl濃度對膠原蛋白溶解度的影響

2.9 雞肺膠原蛋白的吸濕保濕性

2.9.1 雞肺膠原蛋白的吸濕性 圖9是超聲輔助酸提膠原蛋白和酸提膠原蛋白24 h內在20 ℃、相對濕度60%的吸濕性曲線。從圖9中可看出，超聲輔助酸提膠原蛋白的吸濕能力明顯高于酸提膠原蛋白,在24 h時超聲輔助酸提膠原蛋白的吸濕性達到酸提膠原蛋白的1.25倍,說明超聲波處理可以提高膠原蛋白的吸濕能力。膠原蛋白的吸濕性與分子中的親水基團有關,經超聲輔助酸提的膠原蛋白,可能由于超聲波的機械效應和空化效應,蛋白質結構變得疏松,分子內部更多的親水基團暴露,使得膠原蛋白更容易與水分子結合,吸濕性增強。

圖9 雞肺膠原蛋白的吸濕性

2.9.2 雞肺膠原蛋白的保濕性 膠原蛋白中富含甘氨酸、丙氨酸、天門冬氨酸等游離氨基酸,它們是天然保濕因子的主要成分,可起到保持肌膚水分的作用[35]。從圖10可以看出,在RH=25%的一定時間內,超聲輔助酸提膠原蛋白的保濕能力明顯高于酸提膠原蛋白,在24 h時超聲輔助酸提膠原蛋白的保濕性是酸提膠原蛋白的1.17倍。參與保水性變化的主要是游離水,游離水的保持同蛋白質的空間結構、靜電荷量等有密切關系,當蛋白質呈網絡狀疏松結構時,可以包容更多水分,膠原蛋白的三螺旋結構又起到很好的保水作用[36],經過超聲輔助酸提得到的膠原蛋白持水性能增加可能是因為超聲波對蛋白質呈網絡狀疏松結構起到了一定的作用[37],同時又使得蛋白質分子內部親水基團暴露,能與更多的水分子結合。

圖10 雞肺膠原蛋白的保濕性

3 結論

常規提取和超聲輔助酸提的膠原蛋白中甘氨酸含量最高,分別為24.12%和23.93%,亞氨基酸其次,分別為19.74%和22.28%。SDS-PAGE和紫外光譜顯示提取的膠原蛋白純度較高,結構保持較好。傅里葉變換紅外光譜和X-射線衍射光譜說明超聲輔助酸提和常規酸法提取的膠原蛋白都較好地保存了膠原蛋白的三螺旋結構;粒徑分布、掃描電鏡分析和膠原蛋白的溶解性表明了超聲輔助酸提時超聲波的空化效應和機械效應能夠改變蛋白質的顆粒大小和氫鍵組成,蛋白質結構更為疏松,使得膠原蛋白的吸濕性和保濕性均有明顯增強。

本試驗表明了雞肺可作為膠原蛋白的來源,超聲輔助酸法提取能夠在保持了膠原蛋白結構的基礎上,增強吸濕保濕性。超聲輔助酸法提取能有效降低設備的酸腐蝕,節約能耗,是較為可行的方法。所提取的膠原蛋白經加工可用于食品、化妝品、生物醫藥等領域,具有廣闊的發展前景和潛在的商業應用。該研究為后續雞肺膠原蛋白結構和理化性質的進一步研究提供了一定的數據基礎。