肝細胞癌源血液相關外泌體組分通過補體和凝血級聯參與腫瘤組織天然免疫

凌玉金 唐玉蓮 倪安妮 廖成傳 劉明慧 梁禎妮 李曙波 陸瑞群 李根亮

右江民族醫學院,廣西百色市 533000

肝細胞癌是威脅人類健康最主要的消化系統惡性腫瘤之一[1-2]。據最新的中國惡性腫瘤發病和死亡分析報告，我國肝細胞癌發病率已居惡性腫瘤第4位[3]。外泌體是細胞內溶酶體微粒內陷形成的多囊泡，其可通過血液等體液遠距離運輸，靶向作用于細胞和組織，參與抗原提呈、天然免疫以及腫瘤的發生發展等各方面。劉樹業[4]在HCC中發現，外泌體可通過調控HCC腫瘤微環境的耐受情況影響機體的免疫反應。袁正宏[5]在病毒感染機體的過程中亦證明了，外泌體在激活機體免疫反應等方面的突出作用。可見，外泌體在HCC組織中的免疫反應作用逐漸被發現。但是，外泌體參與HCC組織免疫反應的機制機理還有很多地方不清楚，特別是血液相關外泌體在HCC腫瘤組織天然免疫方面的作用目前尚未見報道。

據此，本研究以HCC模型小鼠的瘤體組織和癌旁肝組織為實驗材料，提取各組織中的總RNA，通過RNA-seq和生物信息學手段，分析HCC組織中參與天然免疫反應的肝細胞癌源血液相關外泌體差異表達基因及其功能，并用RT-qPCR驗證實驗結果。通過對差異表達基因分析，探討HCC來源血液相關外泌體組分參與天然免疫反應的可能機制，為臨床腫瘤預防和診治提供幫助作用。

1 材料和方法

1.1 動物模型構建和樣本獲取 鼠齡7周、體重22～25g的健康昆明小鼠100只，隨機分成2組，即肝癌模型小鼠組(60只)和對照組(40只)。對照組用于判斷肝癌模型小鼠建立是否成功。方法：給予肝癌模型小鼠組每只小鼠雙前肢腋下接種0.2ml肝癌細胞系H22細胞(指數增長期細胞，細胞懸液濃度為105個/ml)，對照組同法生理鹽水注射。正常飼養4周后，分別取成瘤小鼠瘤體組織和癌旁肝組織，各自等量混合制成混合樣本。

1.2 樣本RNA提取及RNA-seq 采用RNA提取試劑盒(Invitrogen，中國上海)，分別提取瘤體組織和癌旁肝組織樣本中總RNA，送公司進行RNA-seq分析以獲得兩類樣本中差異表達基因。RNA-seq質量檢測及clean reads篩選按常規程序完成。差異表達基因以兩類樣本中同一基因之間的RPKF值(每百萬測序堿基中或每千個轉錄子測序堿基中所包含的測序片斷數)比值≥2或≤0.5，且FDR(錯誤發現率)值≤0.05的基因為有統計學意義。

1.3 HCC源血液相關外泌體差異表達基因的篩選 以“blood、exosome or exosomal、protein、Innate immunity和Mus musculus”作為關鍵詞，在NCBI中的Nucleotide數據庫中進行HCC源血液相關外泌體基因檢索。將檢索結果與測序數據中的差異表達基因進行比對，篩選出差異表達的HCC源血液相關外泌體基因。

1.4 參與天然免疫反應的HCC源血液相關外泌體差異表達基因的篩選 利用DAVID 6.8軟件對差異表達的HCC源血液相關外泌體基因進行功能富集，篩選出參與天然免疫反應的HCC源血液相關外泌體差異表達基因，以FDR≤0.05的基因為有統計學意義。

1.5 參與天然免疫反應的HCC源血液相關外泌體差異表達基因的功能分析 利用DAVID 6.8軟件對參與天然免疫反應的HCC源血液相關差異表達基因進行在線基因注釋及功能富集，以進行GO和KEGG分析。

1.6 參與天然免疫反應的HCC源血液相關差異表達基因的編碼蛋白互作分析 通過STRING數據庫對參與天然免疫反應的HCC源血液相關差異表達基因的編碼蛋白進行互作分析，以評價差異基因在分布和功能上的相關性。

1.7 SNV/INDEL與基因表達的相關性分析 利用Excel軟件對參與天然免疫反應的HCC源血液相關差異表達基因中出現的單核苷酸位點變異(Single nucleotide variants，SNV)及核苷酸插入/刪除(INDEL)情況進行分析，探討其多態性與基因表達異常的相關性。

1.8 RT-qPCR驗證 隨機選擇4個參與天然免疫反應的HCC源血液相關差異表達基因進行RT-qPCR分析，內參基因為β-actin。引物采用Blast-primer軟件進行設計，由上海生工公司合成。

2 結果

2.1 參與天然免疫反應的HCC源血液相關外泌體差異表達基因的篩選結果 通過篩選比對，在健康肝組織和癌旁肝組織中發現了81個參與天然免疫反應的差異表達的HCC來源血液相關外泌體基因。隨機選取的4個差異表達基因RT-qPCR分析結果與RNA-seq結果中的表達趨勢一致，見圖1。RT-qPCR引物見表1。

圖1 RT-qPCR與RNA-seq檢測參與天然免疫反應的HCC來源血液相關外泌體基因的表達情況比較

表1 基因RT-qPCR引物

2.2 參與天然免疫反應的HCC源血液相關外泌體差異表達基因的功能 對81個差異表達基因功能富集，共富集到10個生物學過程(BP)、4個細胞組分(CC)、3個分子功能(MF)和2個KEGG通路(KEGG)。進一步分析這些基因功能，發現它們主要富集在天然免疫反應(39個基因)、血液凝固(25個基因)、炎癥反應(18個基因)、受體結合(16個基因)、絲氨酸型內肽酶活性(16個基因)、絲氨酸型肽酶活性(12個基因)等方面，以及補體和凝血級聯(33個基因)等信號通路上，見圖2和圖3。

2.3 參與天然免疫反應的HCC源血液相關外泌體差異表達基因的編碼蛋白互作 參與天然免疫反應的HCC來源血液相關外泌體基因的編碼蛋白互作情況也表明了這些基因功能密切相關，見圖4。

2.4 SNV/INDEL與基因表達的相關性 SNV/INDEL的分析結果顯示，參與天然免疫反應的HCC來源的81個血液相關外泌體基因共發生了387個SNV和8個INDEL位點的改變。這些基因位點的改變主要發生在基因的6個部位，即外顯子區(exonic)、內含子區(intronic)、基因間區(intergenic)、基因下游區(downstream)、基因上游區(upstream)及拼接區(splicing)，其中外顯子區、內含子區及基因間區3個區域發生這些位點多態性概率最大，見圖5。

圖2 參與天然免疫反應的HCC源血液相關外泌體差異表達基因的功能

圖3 天然免疫反應的HCC源血液相關外泌體差異表達基因參與的補體和凝血級聯信號通路

圖4 參與天然免疫反應的HCC來源血液相關外泌體差異表達基因的編碼蛋白互作

圖5 參與天然免疫反應的HCC來源血液相關外泌體基因的SNV和INDEL分布

3 討論

外泌體是遠程細胞信號傳導的重要載體。在腫瘤組織中，新腫瘤的發生發展與富含多種來自親代腫瘤活性成分的腫瘤源外泌體有緊密聯系[6-7]。腫瘤源外泌體通過樹突狀細胞將腫瘤特異性抗原提呈給CD8+T細胞激發殺傷作用，在抗腫瘤免疫中起重要作用[8]。可見，外泌體與機體的免疫反應有密切聯系。在本研究中，我們發現81個參與天然免疫的HCC源血液相關外泌體基因。這些基因富集到的功能主要包括天然免疫反應、血液凝固、炎癥反應、受體結合等。這表明，我們的研究與其他研究者有同樣的發現,并且我們在富集到的功能中，還發現其中有33個HCC源血液相關外泌體差異表達基因還參與了補體和凝血級聯信號通路。

凝血系統作為機體免疫應答的重要組成部分發揮功能[9]。病原體感染機體會同時激活凝血系統引起血液凝固，血液凝固會進一步限制病原體入侵機體。生物普遍存在的補體和凝血級聯系統以維持天然免疫的激活[9]。這表明補體和凝血級聯與天然免疫有很密切的關系。但補體和凝血級聯與腫瘤源性外泌體的相互作用的報道較少。有報道，肺癌病人外泌體中的補體蛋白C4a在血漿內的表達量明顯高于良性病人[10]。我們研究發現33個基因參與了補體和凝血級聯信號通路，這進一步補充了腫瘤源性外泌體與補體和凝血級聯的密切關系。

那么，血液相關外泌體基因在腫瘤天然免疫中具體有何作用？Huber等[11]發現血液中血小板源性外泌體對凝血途徑的激活作用是外泌體在凝血級聯系統中的主要表現形式之一。約50%惡性腫瘤患者和90%惡性腫瘤轉移的患者凝血系統指標發生不同程度的異常[12]。腫瘤患者機體凝血、抗凝纖溶系統發生失衡，導致血液處于高凝狀態[13]。本研究發現的肝細胞癌源血液相關外泌體組分，從富集到的功能基因的數量上看，HCC源血液相關外泌體組分很可能主要以受體結合、絲氨酸型肽酶催化活性等，通過補體和凝血級聯信號途徑，參與HCC組織中的天然免疫反應。在遠離原病灶的組織中通過激活補體和凝血級聯信號途徑參與防御癌細胞擴散和入侵的天然免疫反應抑制癌細胞的增殖。我們進行的差異基因的SNV/INDEL的分析表明，基因的多態性還很可能在HCC中扮演著重要的調控作用。

綜上所述，本研究探索了HCC來源血液相關外泌體基因參與天然免疫的可能機制，發現HCC源血液相關外泌體組分可能主要以受體結合、絲氨酸型肽酶活性等，通過補體和凝血級聯信號途徑參與天然免疫反應，從而在抑制癌細胞的增殖過程中發揮重要作用。