氨基納米磁珠粒徑大小影響因素研究

紀 欣，白 靜，艾 靜，于加平

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林 吉林 132101)

復(fù)合納米磁珠是一種高通量的材料，可以快速提取生物中的核酸樣本。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，核酸提取需要解決的關(guān)鍵問題也變成了用簡單、快速、適合大眾的方法從多種生物組織中來獲得高產(chǎn)量和高品質(zhì)的基因組DNA[1]。納米磁珠就是指具有納米的超順磁微球，是一種新型的納米材料。使用這種材料提取DNA與傳統(tǒng)的分離方法相比，能將DNA從復(fù)雜的生物樣品中快速分離出來，能夠?qū)崿F(xiàn)分離和富集的同時進行，有效地提高了分離速度和富集效率[2]，同時也使分析檢測的靈敏度大大提升。

1 試劑和儀器

1.1 試劑

二價鐵鹽、三價鐵鹽、氨丙基三乙氧基硅烷、十一烯酸、十二烷基硫酸鈉、四乙氧基硅烷、鹽酸、氨水、油酸(均為北京化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，純度為分析純)。

1.2 儀器

透射電子顯微鏡(JEM-2100UHR型，日本JE-OL公司生產(chǎn))，紅外光譜儀(Avatar-360型，美國尼高力公司生產(chǎn))，電子天平(JA2002，上海精天電子儀器有限公司生產(chǎn))，烘干箱(DZF-6020型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn))，超聲波清洗儀(KL-040型，深圳市科力超聲波洗凈設(shè)備有限公司生產(chǎn))，水浴搖床(YXQ.SG41.280，海生銀醫(yī)療儀器儀表廠生產(chǎn))。

2 試驗方法

2.1 氨基納米磁珠的制備

量取100 mL水于500 mL三口瓶中，繼續(xù)進行超聲溶解10 min。通入N2，加入3.80 g FeCl2·4H2O，溶解后再超聲超10 min[3]。迅速加入9 mL氨水并伴隨劇烈的攪拌，觀察到有Fe3O4粒子生成后開始緩慢加入油酸15 mL，在70℃的溫度下，劇烈攪拌1 h。所得產(chǎn)物備依次用水和丙酮洗滌多次，直至清洗看到磁性納米顆粒。將所得產(chǎn)物進行干燥備用。將干燥后的磁流體粉末稱取0.74 g，溶于6 mL石油醚[4]中，將其所得的產(chǎn)物進行超聲10 min左右，使其均勻分散。在24 mL水中使用移液器量取550μL十一烯酸加入，使用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0。親水性磁流體的制備：取反應(yīng)后的磁性顆粒溶液4 mL，逐滴加入到十一烯酸鈉溶液中，進行1 h的劇烈攪拌即可得到。取一定量的過硫酸鉀、所制備的水溶性磁流體及450 μL石油醚放置于單口瓶中，通N2排盡瓶內(nèi)空氣后進行密封。將單口瓶置于水浴搖床中70℃加熱24 h。制備的磁性微球分別用水和乙醇洗滌2～3次，分散于乙醇溶液中備用。取1 g磁性微球加入100 mL 80%的乙醇水溶液中，將其分散均勻。依次加入0.4 mL氨水和0.25 mL四乙氧基硅烷，室溫超聲3 h。產(chǎn)物依次用無水乙醇和蒸餾水進行洗滌，洗滌完成后進行干燥，即得表面硅羥基包覆的磁性微球。取1 g表面硅羥基修飾的磁性微球分散于100 mL 80%的乙醇水溶液中，加入0.4 mL氨水和0.25 mLγ-氨丙基三乙氧基硅烷，室溫超聲3 h。所得產(chǎn)物用無水乙醇和蒸餾水洗滌，干燥后即得表面氨基包覆的磁性微球[5]。

2.2 過硫酸鉀的量對納米磁珠粒徑大小的影響

在2.1試驗方法基礎(chǔ)上，固定溫度為70℃、加入0.25 mL四乙氧基硅烷的條件下，分別稱取0.010 00 g、0.015 00 g、0.020 00 g過硫酸鉀的量，制備復(fù)合氨基納米磁珠。

2.3 四乙氧基硅烷的量對納米磁珠粒徑大小的影響

在2.1方法基礎(chǔ)上，固定在溫度為70℃、加入0.015 00 g過硫酸鉀的條件下，分別加入0.15 mL、0.25 mL、0.35 mL的四氧基硅烷，制備復(fù)合氨基納米磁珠。

2.4 溫度的變化對納米磁珠粒徑大小的影響

在2.1方法基礎(chǔ)上，固定加入0.25 mL四乙氧基硅烷、0.015 00 g過硫酸鉀的條件下，改變水浴搖床的溫度為80℃、70℃、60℃，制備復(fù)合氨基納米磁珠。

3 結(jié)果與分析

3.1 氨基納米磁珠制備的結(jié)果

取1 g制備完成的氨基納米磁珠，將其在無水乙醇溶液中進行分散，加入適量的茚三酮，密封后進行加熱，可以觀察到三角瓶中的溶液由黃色逐漸變?yōu)樽仙醋C明所制備磁性微球上含有氨基。

3.2 運用電鏡對制備的納米磁珠進行表征

3.2.1 過硫酸鉀的量對納米磁珠粒徑大小的影響

按2.2方法制得氨基納米磁珠，經(jīng)電鏡掃描，結(jié)果如圖1所示。圖1A1、A2、A3分別為0.010 00 g、0.015 00 g、0.020 00 g 過硫酸鉀所制備的氨基納米磁珠。由圖可知，含量為0.015 00 g 的過硫酸鉀所修飾的納米磁珠粒徑大小均一，分散性較好，因此本試驗加入0.015 00 g 的過硫酸鉀為宜。

3.2.2 四乙氧基硅烷的量對納米磁珠粒徑大小的影響

按2.3方法制得氨基納米磁珠，經(jīng)電鏡掃描，結(jié)果如圖2所示。圖2B1、B2、B3分別為0.15 mL、0.25 mL、0.35 mL四乙氧基硅烷所制備的氨基納米磁珠。由圖可知，0.25 mL四乙氧基硅烷所修飾的納米磁珠粒徑大小均一，均為400 nm左右，從而使用0.25 mL四乙氧基硅烷對納米磁珠進行修飾可以保證納米粒子的高吸附量，并減小修飾對磁性納米顆粒的影響，故應(yīng)當加入0.25 mL四乙氧基硅烷。

3.2.3 溫度的變化對納米磁珠粒徑大小的影響

按2.4方法制得氨基納米磁珠，經(jīng)電鏡掃描，結(jié)果如圖3所示。圖3C1、C2、C3分別為80℃時、70℃時、60℃時所制備的氨基納米磁珠。由圖可知，當溫度為70℃時，所制備的納米磁珠粒徑均勻，粒徑大小普遍為400 nm，分布較均勻，故本研究認為應(yīng)采用70℃為宜。

圖1 不同量過硫酸鉀制備氨基納米磁珠的電鏡掃描圖Fig.1 Scanning electron microscope of amidogen nanometer beads prepared by different volume of potassium persulfate

圖2 不同量四乙氧基硅烷制備氨基納米磁珠的電鏡掃描圖Fig.2 Scanning electron microscope of amidogen nanometer beads prepared by tetraethoxy-silicanen of different volumes

圖3 不同溫度制備氨基納米磁珠的電鏡掃描圖Fig.3 Scanning electron microscope of amidogen nanometer beads prepared under different temperatures

3.3 利用紅外光譜對制備的納米磁珠進行表征

通過TEM可得在70℃，加入0.015 00 g過硫酸鉀、0.25 mL四乙氧基硅烷的氨基納米磁珠為最佳，使用此試劑含量的條件下將所制得的磁性納米顆粒通過磁分離和超聲分散的方式，分別使用去離子水和無水乙醇進行3次以上的清洗，一直到紅外光譜儀檢測無有機物被洗出之后，所得的磁性微球粉末干燥后進行KBr壓片制樣，然后使用紅外光譜儀測定磁性微粒的紅外光圖譜。如圖4所示。圖4為氨基納米磁珠的紅外圖譜，在548 cm-1處有一強吸收峰，對應(yīng)Fe3O4的Fe-O特征伸縮吸收峰，圖中峰形完整，說明了磁性納米顆粒成功結(jié)合。811 cm-1和1 387 nm-1分別為Si-O-Si的對稱和不對稱伸縮振動吸收峰，1 289 cm-1處為Si-O-Si的彎曲振動峰，說明四乙氧基硅烷修飾成功。2 932 cm-1處為C-H對稱振動峰，2 331 cm-1處為N-H鍵變形振動峰，說明氨基納米磁珠制備成功。

圖4 紅外光圖譜Fig.4 Infrared spectrum

4 結(jié)論

以Fe3O4納米材料為磁性核，以共沉淀法研制的復(fù)合納米磁珠，再以三價鐵鹽和二價鐵鹽為原料在堿性條件下制備Fe3O4納米材料，經(jīng)電鏡表征和紅外表征確定過硫酸鉀的量為0.015 00 g、四乙氧化硅烷0.25 mL、水浴加熱70℃所制得的氨基納米磁珠粒徑大小均勻，利用所得到的納米磁珠對DNA進行提取，所提取的DNA的純度較高，所制備的復(fù)合納米磁珠性能比較穩(wěn)定。

氨基納米磁珠為分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)學(xué)的研究提供一種高性能的分離純化材料，進而為其發(fā)展提供強有力的理論基礎(chǔ)。可為新型的生物提取分離手段提供所需高效材料的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。制備新型、高性能、穩(wěn)定的多種物質(zhì)包埋式納米磁珠為生命科學(xué)、食品科學(xué)、醫(yī)學(xué)等方面的研究提供一種高效的材料。