桂參通脈膠囊對心衰大鼠心室重構MMP-1及TIMP-1的表達研究

趙中秋，高琪，梁君昭，劉暢，徐洋，劉鑫，譚毅

(1.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046；2.西安市中醫醫院，陜西 西安 710021)

慢性心力衰竭(CHF)是一種由多種因素引發的心臟結構和功能異常的疾病，是心血管疾病發生和發展的終末期，臨床表現為患者心臟排血量不足、充盈能力低下、全身組織器官灌注不足等癥狀。眾多患者深受其擾，有研究證實，歐洲5億人口中患有CHF有200萬～1 000萬之多，且4年生存率僅為50%，在我國，以心力衰竭為因的死亡人數較過去40年增加了6倍。而美國大約有500萬患者，且每年新增的心衰患者超過55萬之多[1-2]。

近年來對該病的研究逐步深入，目前其治療方案多以利尿強心擴管為主，需長期口服相關藥物，不僅治療費用昂貴，而且現代藥物的毒副作用也不可忽視，如抗心律失常藥物最易引起心律失常，常用藥物阿托品，其藥理作用多，甚者易出現中樞不良反應，某些治療心衰的藥物如PDEs、Ca2+通道阻滯劑等，實際上可能對心衰弊大于利。

中醫藥治療該病療效確切，毒副作用較小，特別是中醫藥針對心力衰竭發展的不同階段的辨證施治，充分體現了中醫藥治療該病的獨特優勢。為此，筆者在中醫藥理論指導下，結合西安市中醫醫院長期臨床實踐經驗，參照現代藥理研究成果，將桂枝、黨參、茯苓、葛根、郁金等藥物在嚴格的藥房制劑規范下制成具有補氣益心、活血通脈、化痰祛濁的桂參通脈膠囊。該制劑經過臨床前期藥效實驗表明，對胸痹之心氣虧虛、心悸乏力、心肌缺血、心律失常等心血管疾病效果確切。

慢性心力衰竭(CHF)主要的病理改變是心室重塑，究其原因，應與交感神經系統、RAAS系統、基質金屬蛋白酶(MMPs)、基質金屬蛋白酶抑制酶(TIMPs)等的平衡失調與紊亂有關。因此，穩定MMPs與TIMPs平衡，延緩心室重構，減慢心衰進度，是治療慢性心衰的路徑之一。在前期臨床研究的基礎上，筆者初步假設,桂參通脈膠囊防治心衰的機理可能與調控神經內分泌、改善血流動力學有關，從而抑制神經體液機制，阻斷RAAS系統，阻止和延緩心室重構，達到減少心衰復發、延緩病程、延長生存期的目的。因此，本研究主要通過應用桂參通脈膠囊干預心衰大鼠模型，從MMP-1及TIMP-1的角度探討桂參通脈膠囊對心室重構的影響。

1 資料與方法

1.1 藥物與試劑

桂參通脈膠囊由西安市中醫醫院提供，規格：0.45 g×36粒；卡托普利，12.5 mg/粒(湖南漢森制藥股份有限公司，批號：H43021388)；0.9%氯化鈉注射液；肝素鈉注射液；注射用鹽酸阿霉素(鹽酸多柔比星)；MMP-1、TIMP-1抗體。

1.2 動物分組

選取雄性SD大鼠60只，體質量200～250 g。按照隨機數字表隨機將其分為正常對照組、心衰模型組和桂參通脈低、中、高劑量組及卡托普利組，每組各10只。除正常對照組外，其余大鼠以腹腔注射鹽酸阿霉素(ADR)造模。

1.3 造模方法

注射用鹽酸阿霉素加入滅菌注射用水5 mL使之溶解，后加置0.9%生理鹽水中，配成每1 mL生理鹽水含鹽酸阿霉素0.8 mg的溶液。除正常對照組外，其余分別在第1、3、5周大鼠腹腔注射鹽酸阿霉素溶液3 mg/kg，在第2、4、6周腹腔注射鹽酸阿霉素溶液2 mg/kg，每周1次，共注射6次，每只大鼠累積用量為15 mg/kg。正常對照組同時腹腔注射等容積的生理鹽水。造模成功的指標為：造模組大鼠表現萎靡不振，進食、活動量減少，體質量、體溫明顯下降，心功能測定其舒張期心臟左室內壓變化最大速率及心率值均明顯低于正常組。

1.4 給藥方法

桂參通脈低、中、高劑量組分別給予0.034 g/(kg·d)、0.068 g/(kg·d)和0.135 g/(kg·d)桂參通脈膠囊，卡托普利組給予6.75 mg/(kg·d)卡托普利，空白對照組和心衰模型組給予同體積蒸餾水灌胃，連續給藥4周。

1.5 觀察指標

于小鼠心臟左室前壁處取一定重量的心肌組織，采用蛋白免疫印記法(Western blot)測定MMP-1、TIMP-1的活性，用凝膠成像系統量化分析各組間MMP-1、TIMP-1吸光度。

1.6 統計學處理

2 結果

結果顯示，MMP-1在心衰模型組的表達程度顯著升高，通過桂參通脈膠囊干預后發現，中、高劑量組可顯著降低MMP-1蛋白表達，且明顯低于卡托普利組(P>0.05);與心衰模型組相比，卡托普利組、桂參通脈中、高劑量組分別是其0.77倍、0.56倍、0.54倍。TIMP-1的蛋白在正常對照組表達最高，心衰組表達最低，通過桂參通脈膠囊干預后發現，卡托普利組、桂參通脈中、高劑量組均明顯上調，其中以桂參通脈高劑量組上調明顯(P<0.05)。結果見表1和圖1～圖4。

表1 各組大鼠血清MMP-1和TIMP-1水平比較

圖1 Western blot法測定MMP-1表達

圖2 MMP-1顯色結果吸光度值

圖3 Western blot法測定各組TIMP-1表達結果

圖4 TIMP-1顯色結果吸光度值

3 討論

桂參通脈膠囊是由桂枝、黨參、黃芪、炒白術、葛根、川芎、郁金、茯苓、清半夏和延胡索等藥物組成的純中藥復方制劑[3]，具有補氣益心、活血通脈、化痰祛濁之功。其中桂枝、黨參為君藥，以助陽行氣、溫通經脈；黃芪、茯苓、炒白術共為臣藥，以健脾、寧心、益氣；葛根、郁金、川芎、清半夏、延胡索為佐藥，其中前三者可升陽活血、清心解郁；延胡索可達活血散瘀、理氣止痛之功。從現代藥理來看，上述藥物均有擴張血管、強心利尿等作用[4-7]，與現代醫學治療心力衰竭的“黃金三角”一致。

在心力衰竭心室重塑演變過程中，心肌細胞和細胞外基質(ECM)膠原網架、血管床的組成和形態結構發生改變，使得心肌順應性及收縮力下降，從而導致心功能不全[8]。其中引起左心室擴大及心室重構的關鍵因素是ECM成分的合成及代謝失衡，生理狀態下，ECM是連接心肌細胞的重要組成部分，起著信息傳遞、細胞支架及協調心肌舒張收縮功能的重要作用，對維護心臟結構與功能完整性有重要意義。而膠原代謝過程因受眾多因素調控而更為復雜，基質金屬蛋白酶( MMPs) 是一類含有鋅離子的內源性蛋白水解酶，當pH值合適時，其可將ECM 的大部分成分完全降解，內源性抑制劑基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs) 作為MMPs 的天然抑制劑。MMP/TIMP介導的膠原降解是心肌重塑和心功能不全的主要過程[9]。

MMP-1是 MMPs家族中的一員，參與細胞外基質調節過程及心肌重構，且發揮重要作用，其來源于心肌纖維細胞的分泌，正常人組織中MMP-1表達水平極低，但在病理性修復或重塑過程中，細胞因子等因素刺激情況下，體內MMP-1水平明顯增加。當心肌細胞受損時，MMP-1 將被大量釋放到血清中，導致血清中MMP-1水平顯著上升[9]。TIMP是一種內源性糖基化蛋白質，作用是抑制MMPs的生物活性，可調控MMPs的生物活性與代謝，調節細胞增殖、分裂與死亡；由成纖維細胞、其他結締組織細胞及較廣范圍的其他細胞所分泌，廣泛存在于組織和體液中與MMP-1有高度親和性，抑制其活性表達。因此，TIMP-1/MMP-1的平衡是活性中心以1∶1的比例結合，阻斷MMP-1與底物的結合，抑制其活性，從而減少MMP-1對膠原基質的降解。

在心衰發展過程中，由于心臟生理性代償機制，導致心肌間質重塑，造成心臟結構擴大，心肌順應性減低，收縮力不足，致使心輸出量減低，導致一系列并發癥發生。本實驗采用酶聯免疫吸附法和蛋白質免疫印跡法，觀察CHF大鼠MMP-1、TIMP-1水平。與正常對照組相較，心衰模型組MMP-1水平、MMP-1/TIMP-1比值明顯升高，TIMP-1水平明顯減低。TIMP-1對MMP-1的抑制作用減弱，細胞外基質中的膠原蛋白降解，致使重構發生。與心衰模型組比較，各用藥組MMP-1水平、MMP-1/TIMP-1比值下降，TIMP-1水平升高。針對MMP-1，下降最為顯著的是桂參通脈膠囊高劑量組，中劑量組次之。針對TIMP-1，上升最為顯著的是桂參通脈膠囊高劑量組，中劑量組和卡托普利組次之。桂參通脈膠囊高劑量組MMP-1水平、MMP-1/TIMP-1比值下降，TIMP-1水平升高，優于卡托普利組。

綜上，筆者認為桂參通脈膠囊能降低CHF大鼠MMP-1水平，提高TIMP-1的表達，降低MMP-1/TIMP-1比值，延緩CHF發展，逆轉心室重構。