三陰性乳腺癌組織中DSN1的表達變化及其與預后的關系

全秀蓮，朱金明，陳曦，張宇，冀學寧

大連大學附屬中山醫院，遼寧大連 116001

三陰性乳腺癌是指HER-2、雌激素和孕激素受體均為陰性的乳腺癌，其惡性程度高，侵襲能力強，臨床治療效果差，是預后最差的乳腺癌類型，嚴重威脅患者生命健康[1]。因此，迫切需要明確三陰性乳腺癌潛在的分子機制，并尋找新的生物靶標，改善臨床結局。90%腫瘤存在染色體結構或數目的異常改變，這種現象又被稱為染色體不穩定，有些甚至出現在癌前病變和原位癌階段，這有利于腫瘤的惡性轉化及侵襲轉移[2]。DSN1是動粒蛋白結構核心成分，在細胞有絲分裂過程中連接紡錘體與染色體，精準調控染色體分離過程[3]。研究[4,5]表明，DSN1與細胞惡性轉化和腫瘤進展有關，可影響腫瘤的細胞周期和生物學復制過程。但DSN1在乳腺癌中的表達和功能仍不清楚。本研究觀察了三陰性乳腺癌組織中DSN1的表達情況，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇我院2012年1月～2015年12月接受手術切除的120例三陰性乳腺癌患者。患者均為女性，年齡(46.7±11.3)歲，BMI≥28 kg/m267例、<28 kg/m2為53例，腫瘤直徑<2 cm 39例、≥2 cm 81例，組織學類型中浸潤性導管癌91例、浸潤性小葉癌9例、髓樣癌3例、其他17例，有淋巴結轉移71例、無淋巴結轉移49例，TNM分期Ⅰ+Ⅱ期53例，Ⅲ+Ⅳ期67例，遠處轉移18例、無遠處轉移102例。所有患者經兩位病理醫師首次明確診斷為三陰性乳腺癌且術前未接受化療或放療。納入標準：患者除患乳腺癌外，不存在其他部位的惡性腫瘤；心肝腎功能能耐受手術；存在完整的臨床病歷資料和隨訪信息；不存在任何遺傳性疾病。本研究通過醫院倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書。

1.2 三陰性乳腺癌組織中DSN1檢測方法 手術切除所有患者腫瘤組織，石蠟包埋，用甲醛固定切成4 μm切片，脫蠟并在梯度乙醇中再水合。在pH6.0的乙二胺四乙酸緩沖液中煮沸切片3 min進行抗原修復。用3%過氧化氫淬滅內源過氧化物酶活性30 min。使用兔單克隆抗DSN1抗體(ab184441，Abcam，Cambridge，UK)在4 ℃下將TMA載玻片染色過夜，再與辣根過氧化物酶綴合的抗兔二抗(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)在37 ℃溫育30 min。然后使用辣根過氧化物酶和3,3′-二氨基聯苯胺色原溶液處理載玻片并用蘇木精復染。采用陽性染色細胞的百分比結合染色強度半定量地對DSN1表達進行評分。染色強度陰性計為0分，弱陽性計為1分，中度陽性計為2分，強陽性計為3分。DSN1陽性細胞的百分比占0～10%計為1分，>10%～50%計為2分，>50%～80%計為3分，>80%計為4分。將兩者得分相乘，≤3為DSN1低表達，≥4為DSN1高表達。

1.3 隨訪方法 采用定期返院復診及電話進行隨訪，術后半年內每2個月復診1次，半年后每3個月復診一次，每月電話隨訪1次。記錄所有患者的總生存時間(從手術到患者死亡的時間；如患者健在，則為從手術到最后一個隨訪日的時間)及無瘤生存時間(從手術到首次隨訪發現復發或隨訪截止日之間的時間)。計算5年無瘤生存率(術后5年未復發的患者人數/總患者人數×100%)和5年總生存率(術后5年仍健在的患者人數/總患者人數×100%)。

1.4 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法和Cox比例風險模型分析三陰性乳腺癌患者癌組織中DSN1表達與患者預后關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三陰性乳腺癌組織中DSN1的表達情況 三陰性乳腺癌組織中DSN1蛋白陽性染色主要定位于細胞質。120例患者中75.8%(91/120)DSN1高表達、24.2%(29/120)DSN1低表達。

2.2 DSN1表達與三陰性乳腺癌臨床病理特征的關系 結果見表1。

2.3 DSN1表達與三陰性乳腺癌預后的關系 DSN1高表達者5年無瘤生存率和總生存率分別為12.4%(11/91)、18.7%(17/91)，DSN1低表達者5年無瘤生存率和總生存率分別為17.2%(6/29)、24.1%(7/29)，DSN1高表達者無瘤生存率和總生存率均低于DSN1低表達者(P均<0.01)。

單因素Cox回歸分析顯示，DSN1表達、TNM分期、淋巴結轉移和遠處轉移與三陰性乳腺癌患者無瘤生存率有關(P均<0.05)；多因素Cox回歸分析表明，DSN1表達(HR=1.091，95%CI：1.082～3.75，P=0.001)是三陰性乳腺癌患者無瘤生存率獨立預測因子；見表2。

單因素Cox回歸分析顯示，DSN1表達、TNM分期與三陰性乳腺癌患者總生存率有關(P均<0.05)；多因素Cox回歸分析表明，DSN1表達(HR=1.887,95%CI：1.591～4.528,P=0.003)、TNM分期(HR=1.368，95%CI：0.577～2.734，P=0.013)可作為三陰性乳腺癌患者總生存率的預測因子；見表3。

表1 DSN1表達與三陰性乳腺癌臨床病理特征的關系(例)

3 討論

三陰性乳腺癌ER、PR受體和HER-2存在表達缺陷，內分泌和靶向治療效果差，該型腫瘤侵襲力強，傳統治療效果欠佳，是乳腺癌治療領域的難點[2,6,7]。癌癥的出現是遺傳與環境共同作用的結果，染色體的異常改變是腫瘤出現的常見原因[2]。染色體的適當分離對于遺傳物質的傳遞十分重要，動粒蛋白為染色體分離提供動力，精準時序調控染色體分離過程；DSN1是人體細胞有絲分裂中動粒蛋白組裝所必需的蛋白，動粒組裝是染色體分離的關鍵步驟，對細胞周期進展十分關鍵[8]。

最近研究表明，DSN1與細胞惡性轉化和腫瘤進展有關[5]。研究發現，原發性肝細胞癌組織中64.2%呈現DSN1高表達，35.3%呈現DSN1低表達[4]。亦有報道肺癌組織中DSN1存在高表達現象[9]。本研究發現，120例三陰性乳腺癌患者中75.8% DSN1高表達，24.2% DSN1低表達。這些研究結果說明，在肝癌、肺癌、乳腺癌組織都出現了DSN1高表達，提示DSN1有可能成為新的腫瘤標記物，為臨床腫瘤的診治提供新的思路。

研究發現，DSN1與肝癌[4]、肺癌[9]、結腸癌[3]的惡性轉化和腫瘤的侵襲進展密切相關。有文獻[4]報道,在肝細胞癌患者中，DSN1高表達可為肝細胞癌術后總生存率的獨立危險因素。有學者檢測了結直腸癌癌組織和癌旁組織中基因的表達差異，發現DSN1高表達且可區分正常結腸組織和癌變組織，但其并未探討DSN1高低表達對結直腸癌患者預后的影響[3]。本研究發現三陰性乳腺癌組織中的DSN1表達與TNM分期和淋巴結轉移有關，與年齡、肥胖、腫瘤直徑、組織學類型和遠處轉移無關，DSN1高表達三陰性乳腺癌患者腫瘤顯示出更高的惡性程度。本研究生存分析發現，DSN1高表達三陰性乳腺癌患者的預后低于DSN1低表達患者，Cox比例風險模型分析提示DSN1表達為患者無瘤生存率和總生存率獨立預后因素。提示DSN1高表達是三陰性乳腺癌患者預后不良的獨立危險因素，是可能預測三陰性乳腺癌預后新的分子標志物。亦有研究發現，乳腺癌HER2陽性和陰性的基因結構變化是不一致的,在HER2陰性的乳腺癌基因測序中能夠明顯發現DSN1基因擴增，推測有可能是DSN1基因擴增促進HER2表達陽性的改變發生[10]。這些為后續深入挖掘DSN1作為乳腺癌的生物靶標奠定了基礎。

表2 三陰性乳腺癌患者無瘤生存率預測因素的Cox比例風險模型分析

表3 三陰性乳腺癌患者總生存率預測因素的Cox比例風險模型分析

DSN1高表達和三陰性乳腺癌患者不良預后相關的機制尚不清楚，其可能機制為染色質的不穩定導致細胞遺傳物質的不穩定。染色體分離過程出現異常或染色體錯配則會導致多倍體或突變發生，即出現基因不穩定性[11,12]，這是腫瘤發生和進展的重要原因。調控動粒蛋白能對腫瘤的生長、凋亡、侵襲轉移造成重大影響[13～15]。DSN1缺乏的腫瘤細胞能夠觀察到染色體錯位和有絲分裂延遲；DSN1敲除的腫瘤細胞仍然能夠存活，但其惡性細胞的增殖、遷移、侵襲能力大大下降[16]。DSN1在三陰性乳腺癌方面的機制是否涉及有絲分裂或其他特定機制需要進一步研究。

綜上可見，DSN1在三陰性乳腺癌組織中高表達，且與患者TNM分期和淋巴結轉移密切相關；DSN1高表達是三陰性乳腺癌預后不良的獨立危險因素，可能是預測三陰性乳腺癌預后新的分子標志物。但本研究納入樣本量少，存在一定局限性，DSN1影響三陰性乳腺癌患者預后的分子機制尚需要進一步研究。