結直腸癌組織中miR-92b-3p、FBXW7的表達變化及臨床意義

張文天，劉杰，杜錦波

滄州市人民醫院，河北滄州 061000

結直腸癌是源自腸道上皮的惡性腫瘤，其發病率和病死率在惡性腫瘤中分別居第三位和第四位，對人類生命安全造成巨大危害[1]。結直腸癌起病隱匿，初期常無特異癥狀且易轉移，多數患者確診時癌癥已經處于進展期，手術效果較差，病死率和復發率均較高[2]。因此，進一步探尋結直腸癌的病變機制及關鍵靶點對研發靶向藥物和早期篩查至關重要。微小RNA(miRNA)是一類在真核生物中常見的非編碼RNA，其與3′非翻譯區結合后能夠調控轉錄及翻譯過程，參與細胞增殖和凋亡等[3]。miR-92b-3p屬于miR-25家族，參與合成mRNA-蛋白復合物，在細胞周期中調控G1/S期，進而促進腫瘤細胞增殖[4]。相關研究[5]表明，miR-92b-3p在多種癌組織中表達上調，通過介導PI3K/Akt通路促進癌細胞侵襲及轉移。FBXW7是一種抑癌基因，位于4號染色體q31，其表達缺失或功能紊亂可以導致染色體不穩及腫瘤發生率提高[6]。FBXW7主要受蛋白激酶C調控，通過靶向泛素化使多種轉錄激活因子及其癌蛋白失活，在腫瘤轉移、輔助診斷以及耐藥性等方面具有重要作用[7]。但miR-92b-3p和FBXW7在結直腸癌中的研究較少。因此，本研究觀察了結直腸癌組織中miR-92b-3p和FBXW7的表達情況，并探討其臨床價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年4月～2019年5月我院收治的153例結直腸癌患者。納入標準：所有患者診斷符合《世界衛生組織腫瘤分類診斷系統》[8]中的標準且經術后病理確診為結直腸腺癌；均首次診斷為結直腸癌，且既往未接受過腸道手術或放化療；患者基本信息及病理資料完整，且同意配合本次試驗。排除標準：合并肛周瘺口、結腸穿孔、克羅恩病以及腸道結核等嚴重腸道疾病者；伴有其他原發惡性腫瘤(如膠質瘤、胃癌以及乳腺癌等)者；肝腎功能失代償者；伴有先天遺傳缺陷者。其中男83例、女70例，年齡(56.29±8.51)歲；高分化89例、中分化51例、低分化13例；有淋巴結轉移25例，無淋巴結轉移128例；臨床分期Ⅰ期63例、Ⅱ期60例、Ⅲ期21例、Ⅳ期9例；腫瘤直徑≤5 cm者81例，>5 cm者72例；有遠處轉移19例，無遠處轉移134例。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者知情同意。

1.2 結直腸癌組織中miR-92b-3p、FBXW7表達檢測 采用實時熒光定量PCR技術。術中分別采集癌組織及其癌旁5 cm處正常結腸組織，先在液氮中暫存，術后統一置于-80 ℃冰箱中。以上組織各取50 mg，先于冰上研磨，然后各加入1 mL TRIzol試劑(Invitrogen公司，批號:20170326)，依照操作規范提取總RNA。采用RT Enzyme Mix(Abcam公司，批號:20170322)將提取的10 μg總RNA反轉錄為cDNA。使用SYBR Green Mix試劑盒(Thermo公司，批號20170329)定量檢測miR-92b-3p和FBXW7。反轉錄時miR-92b-3p和FBXW7的反應條件均為42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。miR-92b-3p的正向引物序列為5′-ACACTCCAGCTGGGTATTGCACTCGTCCCGGC-3′、反向引物序列為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGAGGCC-3′;內參基因U6的正向引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、反向引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；FBXW7正向引物序列為5′-CGAACTCCAGTAGTATTGTGGACCT-3′、反向引物序列為5′-TTCTTTTCATTTTTGTTGTTTTTGTATAGA-3′;內參基因GAPDH正向引物序列為5′-GCCGCATCTTCTTTTGCGTCGC-3′、反向引物序列為5′-TCCCGTTCTCAGCCTTGACGGT-3′。以上引物序列均由上海生工生物公司合成。miR-92b-3p和FBXW7的PCR反應體系為SYBR Green Mix 10 μL、正反向引物均為1 μL、dH2O 8 μL、cDNA template 1 μL，共計20 μL。miR-92b-3p和FBXW7的PCR反應條件均為預變性95 ℃ 2 min、變性94 ℃ 20 s、退火58 ℃ 20 s、延伸72 ℃ 20 s，共計40個循環，每個樣本均測量3次。以2-ΔΔCt法計算miR-92b-3p和FBXW7的相對表達量。

2 結果

2.1 結直腸癌組織及其癌旁正常組織中miR-92b-3p、FBXW7表達比較 結直腸癌組織及其癌旁正常組織中miR-92b-3p的相對表達量分別為7.82±1.53、1.69±0.71，而FBXW7的相對表達量分別為0.36±0.13、0.98±0.42。結直腸癌組織中miR-92b-3p相對表達量較癌旁正常組織高，FBXW7的相對表達量較癌旁正常組織低(t=44.954、17.443，P均<0.01)。

2.2 miR-92b-3p、FBXW7表達與結直腸癌臨床病理參數的關系 見表1。

表1 miR-92b-3p、FBXW7表達與結直腸癌臨床病理參數的關系

2.3 結直腸癌組織中miR-92b-3p和FBXW7表達的相關性 結直腸癌組織中miR-92b-3p和FBXW7的表達呈負相關(r=-0.751，P=0.000)。

3 討論

結直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其年均新增病例約140萬，且病死率在癌癥中位居第四位，對人類健康造成巨大危害[9]。基因易感性、家族遺傳、飲食習慣以及地域差異均能夠影響結直腸癌的發生。手術聯合化療是目前治療結直腸癌的常見手段，但由于早期診斷困難、癌癥易轉移和復發，因此療效較差。據相關研究[10]報道，早期診斷的結直腸癌患者5年存活率約為90%，然而，癌胚抗原(CEA)及糖類抗原(CA19-9)等腫瘤標志物的敏感度和特異性均較低，因此深入發掘結直腸癌病變機制及找尋關鍵靶點對早期診斷和延長患者生存時間意義重大。隨著表觀遺傳學和分子生物學的不斷發展，非編碼RNA、DNA甲基化、DNA磷酸化以及組蛋白修飾等過程均被證明能夠使信號傳導通路異常，使原癌基因和抑癌基因功能紊亂，在腫瘤發生及進展中起重要作用[11,12]。

miRNA是由18～25個核苷酸組成的短鏈小RNA，其不能編碼蛋白質且具有高度保守性，但能夠結合3′端的非編碼區對細胞分化、增殖及遷移等過程起到調控作用。miRNA的調控網絡比較復雜，其序列突變、表達異常以及甲基化均會導致miRNA功能失調，進而使細胞增殖、分化及凋亡等過程發生紊亂，增加正常細胞演變為腫瘤細胞的概率[13]。miR-92b屬于miR-25家族，由miR-92b-3p和miR-92b-5p兩條miRNA分子組成，其中miR-92b-3p能夠進入mRISC中進而促進miRNA成熟[14]。既往研究[15]表明，miR-92b-3p能夠通過抑制其靶基因p57，從而導致許多抑癌基因甲基化，使癌細胞異常增殖。本研究結果表明，結直腸癌組織中miR-92b-3p的相對表達量較癌旁正常組織高，其原因可能為癌組織中的原癌基因c-myc表達上調，通過結合miR-92b-3p啟動子區域的E-box位點誘導miR-92b-3p表達，使miR-92b-3p表達提高[16]。本研究結果表明，結直腸癌組織中miR-92b-3p的表達與臨床分期、淋巴結轉移及分化程度有關，且惡性度越高，其表達量越高。其機制可能為miR-92b-3p通過抑制抑癌基因NLK和DKK3，進而調節Wnt/Beta-catenin信號通路，增強癌細胞的增殖及侵襲能力[17]。當抑制miR-92b-3p時，癌細胞的細胞周期受阻，癌細胞的克隆和增殖能力減弱[17]，表明miR-92b-3p對癌癥的分化、侵襲和轉移起促進作用。

FBXW7屬于F-box蛋白家族，由F-box結構域、D結構域以及WD40重復序列組成，可以通過連接SKP1并結合SCF復合物，使多種靶蛋白泛素化及降解。既往研究[18]表明，c-myc、Notch、細胞周期蛋白E(cyclin E)以及Presenilin等基因均是SCF FBXW7 E3連接酶的底物，通過調控其表達使FBXW7在細胞分裂、分化及維持細胞干性等途徑中起關鍵作用，降低細胞癌變的風險。本研究結果表明，結直腸癌組織中FBXW7的相對表達量較癌旁正常組織低，其原因可能為癌細胞的基因缺失、基因突變以及啟動子甲基化相互作用，共同導致癌組織中的FBXW7表達下調[19]。本研究結果表明，FBXW7的表達與臨床分期、淋巴結轉移及分化程度有關，且惡性度越高，其表達越低，表明FBXW7能夠抑制惡性腫瘤進展，且可能作為判斷病情程度的依據。其原因可能為FBXW7的外顯子能夠直接結合p53，使蛋白酶通過泛素化靶向降解多種原癌基因產物，抑制癌細胞增殖并誘導其凋亡，最終阻斷或延緩癌細胞侵襲或轉移[18]。此外，FBXW7還可以抑制cyclin E，維持染色體相對穩定，避免染色體損傷或發生基因突變，而在癌組織中，FBXW7表達下降，對cyclin E的負性調控能力減弱，進而使癌細胞易于分化及侵襲[20]。

本研究結果顯示，癌組織中的miR-92b-3p和FBXW7表達呈負相關，表明miR-92b-3p可能靶向調控FBXW7，使其表達下調從而促進腫瘤形成和進展。其機制可能為miR-92b能夠結合FBXW7的3′非編碼區，進而抑制其表達，加速癌細胞侵襲。c-myc與FBXW7呈負反饋調節，而c-myc則可以誘導miR-92b-3p表達，間接表明miR-92b-3p與FBXW7呈負相關[21]。

綜上所述，結直腸癌組織中miR-92b-3p表達增加，而FBXW7表達降低，二者均與臨床分期、淋巴結轉移以及分化程度有關，未來可能作為臨床評估患者病情進展程度及藥物治療的靶點。