大鼠坐骨神經慢性卡壓損傷后背根神經節纖維化機制探討

黎琴文，黃小燕

1三峽大學人民醫院·宜昌市第一人民醫院，湖北宜昌 443000;2蘭州大學第一醫院

周圍神經慢性卡壓損傷指周圍神經在特定部位受到周圍組織的壓迫，引起周圍神經電生理學改變，從而導致神經支配區疼痛、感覺及運動功能障礙等[1,2]。慢性神經卡壓損傷可導致神經組織微血管缺血改變，加重神經束膜水腫、增厚及局部纖維化，阻礙周圍神經對靶器官的營養作用，加劇肢體運動功能的逐步喪失[3]。該病對患者的心理和社會功能影響較大，其發生往往隱匿且發展較為緩慢，及早診斷和治療可以避免周圍神經損傷帶來的感覺和運動功能障礙的丟失。多年來對于周圍神經慢性卡壓損傷的眾多研究主要集中于卡壓神經局部組織和支配骨骼肌的病理機制研究，以往研究報道坐骨神經慢性卡壓損傷可致卡壓神經局部組織和支配骨骼肌形成纖維化[4,5]。2019年3～12月，本研究探討了坐骨神經慢性卡壓損傷是否也可導致背根神經節纖維化的病理改變，并進一步探討背根神經節細胞外基質過度沉積的調控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 7～8周齡普通級SD雄性大鼠30只(三峽大學醫學實驗動物倫理委員會審批，倫理批準號2018030E)，體質量250～300 g，由三峽大學實驗動物中心提供，按照普通級動物標準飼養和管理大鼠(自由進食飲水，每天交替進行12 h光照、12 h黑暗)。

1．2 實驗試劑 蛋白抽提試劑盒(武漢拜意爾生物公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(武漢拜意爾生物公司)，化學發光試劑盒(Millipore公司)，正常羊血清(博士德公司)，兔抗Collagen Ⅰ、TGF-β1多克隆抗體(SantaCruz公司)，p-ERK、p-JNK、p-p38多克隆抗體(CST公司)。

1．3 方法

1．3.1 大鼠坐骨神經卡壓模型構建 取30只SD雄性大鼠，經腹腔注射戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉，大鼠右側大腿背側皮膚備皮，消毒后沿右側坐骨神經走形方向切開皮膚，充分顯露右側坐骨神經,將內徑1 mm、長1 cm硅膠管剖開后，套在顯露的右側坐骨神經周圍，8-0縫線縫合硅膠管切開處，將坐骨神經放回原處，逐層縫合傷口，設為卡壓側。按照同樣方法暴露左側坐骨神經后放回原處縫合傷口設為對照側。

1．3.2 大鼠腓腸肌肌肉萎縮和纖維增生情況觀察 造模3周和8周時，分別取10只SD雄性大鼠，經腹腔注射戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉，用頸椎脫白法處死實驗大鼠，分別切取大鼠卡壓側坐骨神經支配的腓腸肌樣本及對照側腓腸肌樣本。腓腸肌經4%多聚甲醛固定24 h后，石蠟包埋，取腓腸肌肌腹中段處，橫切3～4 μm厚的連續薄片。石蠟切片脫蠟至水，鐵蘇木素染色，酸性乙醇分化，氨水返藍，麗春紅品紅染色，乙酸溶液洗，磷鉬酸分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。Masson三色染色后膠原纖維、黏液、軟骨呈藍色；肌纖維、纖維素和紅細胞呈紅色；細胞核呈藍黑色。用ImageJ圖像分析軟件分別測量并計算腓腸肌橫截面積(CSA)和膠原容積分數(CVF)，CSA和CVF分別用于反映大鼠坐骨神經卡壓損傷后腓腸肌發生肌肉萎縮和纖維增生情況。

1．3.3 大鼠背根神經節Collagen Ⅰ、TGF-β1、p-ERK、p-JNK、p-p38蛋白檢測 ①造模3周時，取10只SD雄性大鼠，經腹腔注射戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉，用頸椎脫白法處死實驗大鼠。打開大鼠胸腔，暴露心臟，從左心室進針，剪開右心耳，同時向左心室內快速注入37 ℃生理鹽水150 mL直至右心耳流出清亮液體，換4%多聚甲醛500 mL先快后慢注入左心室內，直到大鼠肺、肝變白變硬。大鼠背側皮膚備皮，消毒后切開大鼠背側皮膚，充分暴露脊柱，咬除脊柱棘突、橫突等，打開髓腔暴露椎管內脊髓，牽出脊髓，用顯微鑷分別將雙側L4～6背根神經節從椎間孔中牽出，見梭形膨大的背根神經節，沿膨大邊緣截取背根神經節。②將上述背根神經節剪成細小碎片，按每20 mg加入150～250 μL裂解液的比例加入裂解液勻漿直至完全裂解，提取背根神經節組織總蛋白并采用BCA法測定蛋白濃度后，將30 μg蛋白加樣在含0.1% SDS的12%聚丙烯酰胺凝膠上，電泳2.5 h后分離并轉移到硝酸纖維素膜上。將膜在5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，洗膜后加入抗體[內參GAPDH(1∶10 000)、Collagen Ⅰ(1∶5 000)、TGF-β1(1∶500)、p-ERK(1∶1 000)、p-JNK(1∶1 000)、p-p38(1∶1 000)]4 ℃搖床孵育過夜，抗目的蛋白抗體檢測。洗膜后用過氧化物酶綴合的二抗(1∶10 000)室溫孵育2 h，加入ECL顯色液，最后放入X線片夾中曝光、顯影、定影，將膠片進行掃描存檔，Alpha軟件處理系統分析，將目標帶/內參灰度比值作為目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2．1 大鼠卡壓側、對照側腓腸肌CSA、CVF水平比較 造模3周時，卡壓側未見腓腸肌萎縮，但8周時可見腓腸肌萎縮。卡壓側、對照側造模3周后腓腸肌CSA分別為(1 225 288±43 570)、(1 248 091±50 846)μm2，造模8周后分別為(797 525±25 846)、(1 239 353±50 846)μm2，兩側造模8周時相比P<0.05。造模3、8周時，卡壓側均可觀察到腓腸肌膠原纖維增生。卡壓側、對照側造模3周后腓腸肌CVF分別為(15.1±2.1)%、(2.1±0.6)%，造模8周后分別為(21.3±2.2)%、(2.2±0.7)%，兩側造模3、8周時相比P均<0.05。

2．2 大鼠卡壓側、對照側背根神經節Collagen Ⅰ、TGF-β1、p-ERK、p-JNK、p-p38蛋白表達比較 見表1。

表1 大鼠卡壓側、對照側背根神經節蛋白相對表達量比較

3 討論

盡管周圍神經慢性卡壓損傷的病例普遍存在，但是想要特征性描述周圍神經慢性卡壓損傷后的病理改變卻十分困難，有限的人體標本數量限制了進一步研究周圍神經慢性卡壓損傷后的病理機制。本研究采用了Mackinnon設計的大鼠坐骨神經慢性卡壓模型，該模型可以很好地模擬人類慢性神經卡壓損傷后神經組織的病理改變[1,6]。本實驗經過坐骨神經支配的腓腸肌Masson染色分析發現，坐骨神經卡壓損傷3周后坐骨神經支配的腓腸肌內可觀察到膠原纖維增生，坐骨神經卡壓損傷8周后腓腸肌內可同時觀察到骨骼肌萎縮和膠原纖維增生。既往研究報道，周圍運動神經損傷后支配的骨骼肌肌肉組織將發生一系列的變化，在形態學上最主要的表現為肌間隙纖維膠原結締組織增生導致的骨骼肌纖維化和骨骼肌失神經肌萎縮[5]。因此本實驗觀察到的結果可以很好地驗證坐骨神經慢性卡壓動物模型的可靠性和實用性，并且為下一步的研究提供良好的基礎。

既往研究發現，神經卡壓損傷信號可以逆行向上影響背根神經節內神經元形態、表型及其功能[7,8]，據此筆者猜測坐骨神經慢性卡壓損傷后背根神經節可能同樣會發生某些其他改變。以膠原纖維蛋白為主的細胞外基質合成與降解失衡調節著細胞外基質的代謝，膠原纖維蛋白也是纖維化的重要標志物，尤其是Collagen Ⅰ的異常累積可致組織纖維化，且Collagen Ⅰ在周圍神經組成中占膠原纖維的80%以上[9]。本研究發現大鼠坐骨神經卡壓損傷后卡壓側較對照側背根神經節內Collagen Ⅰ表達升高，說明坐骨神經慢性卡壓損傷可以引起背根神經節細胞外基質沉積和纖維化形成。

TGF-β1作為公認的強致組織纖維化的細胞因子之一，參與了腎臟、肝臟、肺、心臟等器官的纖維化進程[10]。TGF-β1與其受體結合，與Smad2、Smad3和Smad4形成復合物，該復合體從細胞質轉移到細胞核，并調節各種靶基因表達，在成纖維細胞激活、細胞外基質沉積過程中起重要作用[11]。本研究發現卡壓側較對照側背根神經節內TGF-β1表達升高，推測坐骨神經慢性卡壓損傷后背根神經節細胞外基質沉積可能與背根神經節內TGF-β1表達升高有關。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是大多數真核細胞內廣泛存在的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是將細胞外信號轉導到細胞核內，從而引起一系列生物學效應的重要信號傳導系統[12]。它在調控細胞生長、發育、分裂及細胞間功能的同步性等多種生理功能中起重要作用，同樣在成纖維化細胞增殖分化和組織纖維化的病理狀況下也發揮重要作用[13]。此外，MAPK通路可與TGF-β1/Smad信號通路交互調節細胞內Smad分子活性，間接影響纖維化發生發展[14, 15]。本研究發現卡壓側較對照側背根神經節內p-ERK蛋白表達升高，三級級聯反應蛋白激酶Raf/MEK/ERK1/2信號通路能夠將信號從膜傳遞到細胞內能夠調節多種炎性介質及細胞因子的表達，在成纖維細胞增生和細胞外基質沉積中起著關鍵作用[16]。推測背根神經節內成纖維細胞ERK1/2信號通路在坐骨神經慢性卡壓損傷后背根神經節細胞外基質過度沉積和纖維化過程中發揮重要調節作用，背根神經節內TGF-β1與ERK1/2交互調節共同影響坐骨神經慢性卡壓損傷后背根神經節纖維化形成。同時本研究發現，卡壓側背根神經節內p-JNK、p-p38蛋白較對照側表達降低。雖然既往研究發現，在成纖維細胞中，活化的JNK和p38信號通路的磷酸化水平升高參與了組織纖維化進程[17,18]，但是活化的ERK、p38和JNK在不同的細胞類型中可能通過不同的途徑發揮作用，在相同類型的細胞中，這三者在細胞周期等其他方面的功能也可能存在不同[19]。

綜上可見，大鼠坐骨神經慢性卡壓損傷可以引起背根神經節內Collagen Ⅰ上調，可能與背根神經元內TGF-β1表達升高有關，并且可能通過ERK信號通路激活參與背根神經節內細胞外基質沉積和纖維化。因此，詳細了解其涉及的分子生物學機制將可能為該類周圍神經慢性損傷后改善感覺神經元功能提供新的治療方向。