BALB/c裸鼠血管瘤模型的建立及普萘洛爾對其瘤體的抑制作用

安雯婷，郭麗娜，房克峰,姜樂，徐珊，高志嵩，徐偉立

河北醫科大學第二醫院，石家莊 050051

血管瘤是嬰幼兒時期最常見的良性腫瘤，盡管其中某些類型如毛細血管瘤存在緩慢消退的可能，但仍有10%～20%的血管瘤患者存在遺留的外觀損害、破潰、功能障礙等并發癥，嚴重的甚至威脅到生命[1,2]，因此早期治療十分必要。現有治療血管瘤的方法很多，包括手術，激光照射，局部或系統使用皮質類激素、β-腎上腺素受體阻斷劑、干擾素、長春新堿等治療方式[3]。普萘洛爾作為最常見的一種β-腎上腺素受體阻斷劑，目前已成為嬰幼兒血管瘤治療的一線藥物[4]。現有的針對普萘洛爾治療血管瘤的研究大多是基于體外細胞模型，對于動物模型及其給藥方式和量效關系的探討相對較少。因此，2015年1月～2018年12月本研究擬通過建立血管瘤BALB/c裸鼠動物模型，探討普萘洛爾治療動物模型血管瘤的合理給藥劑量和最佳方案，從而為普萘洛爾治療血管瘤的機制研究提供重要的理論和實驗支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器 3～5周齡雌性BALB/c裸鼠40只，體質量15～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。所有裸鼠均在隔離器屏障環境內(SPF級)飼養，飼養水及墊料均經15磅高壓消毒30 min，飼料經紫外線照射30 min。不同濃度(0.01%、0.05%、0.1%)的普萘洛爾溶液(美國sigma公司)；電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；游標卡尺(上海精密儀器儀表有限公司)；全自動高壓滅菌器(日本三菱集團)。

1.2 BALB/c裸鼠血管瘤模型的建立 供體增殖期血管瘤來源于河北醫科大學第二醫院小兒外科住院手術治療的血管瘤患兒(已通過醫院倫理委員會審查，且獲得家長知情同意，并對患者的個人信息進行保密)。無菌條件下手術切除患兒血管瘤組織，部分瘤體組織甲醛固定后送病理學檢查并證實為增殖期嬰幼兒型毛細血管瘤。用生理鹽水處理剩余瘤體組織，剔除瘤體皮下纖維結締組織和脂肪組織，切割成大小為2 mm×2 mm×2 mm的組織塊若干，經皮膚切口移植于40只裸鼠腰背部皮下組織內，每只2處。移植在超凈工作臺內無菌環境下進行，并在標本離體1 h內完成所有移植工作。瘤體植入后定期觀察并測量記錄瘤體生長情況，成瘤標準為皮下結節直徑大于0.5 cm。

1.3 模型動物分組及處理 瘤體移植后第45天將40只荷瘤小鼠隨機分為5組(每組8只)：治療組1，腹腔注射0.01%普萘洛爾溶液0.4 mL，1次/d，持續1周；治療組2，腹腔注射0.05%普萘洛爾溶液0.4 mL，1次/d，持續1周；治療組3，腹腔注射0.1%普萘洛爾溶液0.4 mL，1次/d，持續1周；治療組4，經口灌胃0.01%普萘洛爾溶液0.4 mL，1次/d，持續1周；對照組，腹腔注射蒸餾水0.4 mL，1次/d，持續1周。

2 結果

2.1 各組瘤體體積比較 見表1、2。

表1 腹腔注射不同濃度普萘洛爾對裸鼠瘤體體積的影響

表2 普萘洛爾不同給藥方式對裸鼠瘤體體積的影響

2.2 各組腫瘤組織HE染色情況比較 組織形態學上，對照組內皮細胞富集、纖維組織少，內皮細胞增殖并聚集成團，間隔組織少，界限清晰，細胞呈條索狀或團塊狀排列，形態大小各異，胞核肥大而淡染，呈現增殖的特點。治療組血管瘤的組織結構稀疏，血管內皮細胞明顯減少且分散凌亂，細胞溶解，破碎，局部變性壞死，管腔間有脂肪細胞、纖維細胞增生，細胞核小而染色淺。且普萘洛爾的給藥濃度越高，對內皮細胞增殖抑制作用越明顯，見圖1。

2.3 各組體質量比較 干預后第7、14、21天，治療組1、2、3及對照組兩兩相比，治療組1與治療組4相比，裸鼠體質量比較差異無統計學意義，見表3、4。

3 討論

嬰幼兒血管瘤是由于血管內皮細胞異常增生，發生在皮膚和軟組織的一種良性腫瘤。血管瘤通常在嬰兒出生后1周左右出現；前6個月為快遞增殖期，瘤體增長迅速，形成草莓樣斑塊或腫瘤；6個月后進入晚期增殖期，增長逐漸放緩；1歲后進入消退期并最終緩慢消退，7歲時消退率可達70%[5,6]。盡管血管瘤是一種自限性疾病，但根據其風險等級，部分血管瘤仍需要進行治療，以抑制血管內皮組織增生和促進瘤體消退[7]。《血管瘤和脈管畸形診斷和治療指南》(2016)指出，高風險血管瘤一線治療藥物為口服普萘洛爾，中風險者可局部外用β-腎上腺素受體阻斷劑，低風險者可隨訪觀察[8]。普萘洛爾自2008年首次被報道用于嬰幼兒血管瘤治療，如今成為一線治療藥物，但其具體治療機制仍未完全>闡明[9]。文獻報道有影響內皮細胞因子、成血管因子、生長因子等細胞因子學說，有調節細胞外基質和蛋白酶促進瘤體消退學說，也有促進細胞凋亡學說等[10,11]。截至目前，針對普萘洛爾治療血管瘤的研究大多是利用體外內皮細胞，而利用血管瘤移植動物模型的研究相對較少。

圖1 各組腫瘤組織HE染色(×200)

由于普萘洛爾用于嬰幼兒血管瘤的治療主要基于臨床的意外發現，通過動物模型研究量效關系和作用機制較少。本研究通過建立嬰幼兒血管瘤裸鼠移植模型來探討普萘洛爾的合理給藥劑量和給藥方式，采用不同劑量和不同給藥途徑普萘洛爾對模型裸鼠進行干預，在不同時期觀察裸鼠移植瘤體體積。結果表明，對照組瘤體體積在干預后14天內表現為逐漸增大，第21天時出現縮小，可能與血管瘤存在自身消退的特點有關。同時研究發現，干預后第7、14、21天，治療組1、2、3較對照組瘤體體積小，表明了普萘洛爾對瘤體增殖的抑制作用。干預后第14、21天，治療組3較治療組1、2瘤體體積小，表明隨著治療組普萘洛爾給藥劑量的增加，裸鼠瘤體具有更明顯的消退趨勢，普萘洛爾對裸鼠血管瘤的生長抑制作用具有一定的劑量依賴性。從給藥方式對瘤體消退效果影響來看，干預后第7天，治療組1較治療組4瘤體體積小，但差異并無統計學意義；干預后第14、21天，治療組1較治療組4瘤體體積明顯減小。這可能與腹腔注射只存在肝臟首過代謝，而灌胃存在胃腸和肝臟首過代謝有關，腹腔注射的生物利用度較灌胃高，療效顯著，瘤體體積更小。現有的血管瘤裸鼠模型研究中，普萘洛爾多采用口服灌胃方式，本研究顯示普萘洛爾口服灌胃方式治療效果略差。本研究采用腹腔注射普萘洛爾的方法顯示了較好的治療效果，提供了一種新的給藥治療途徑。各組病理學對比發現，治療組瘤體固縮，毛細血管分布較少，瘤體較治療前顯著縮小，對照組瘤體血供良好，可見少量小血管進入瘤體。結合HE染色結果以及瘤體測量結果，說明普萘洛爾對裸鼠模型血管瘤具有明顯抑制作用。本實驗進一步通過對荷瘤小鼠生長情況進行對比來評估給藥毒性。結果顯示，與對照組相比，治療組裸鼠沒有顯示出體質量差異，說明4個普萘洛爾治療組均在安全劑量范圍內，毒副作用較輕，耐受性良好，對裸鼠機體無明顯損害。

表3 腹腔注射不同濃度普萘洛爾對裸鼠體質量的影響

表4 普萘洛爾不同給藥方式對裸鼠體質量的影響

本研究成功建立了BALB/c裸鼠血管瘤模型，普萘洛爾可抑制模型裸鼠瘤體生長，對裸鼠機體無明顯損害，且腹腔注射較灌胃效果顯著。在此基礎上，后續研究將進一步探討普萘洛爾抗血管瘤作用的相關靶點和機制，以更好地指導其在血管瘤治療中的應用。