GRK5對乳腺癌細胞生物學(xué)行為的影響

紀(jì)曉楠,李勇,李恩杰

本溪市中心醫(yī)院，遼寧本溪 117000

乳腺癌是全球女性中最常見的惡性腫瘤，占2018年新診斷癌癥病例總數(shù)的24%，是2018年癌癥死亡的最常見原因(占總數(shù)的15%)[1]。隨著社會、經(jīng)濟環(huán)境的變化等，乳腺癌的發(fā)病率仍呈上升趨勢。雖然乳腺癌的治療手段在不斷的進步，但是患者預(yù)后仍然較差[2]。遠處轉(zhuǎn)移和化療耐藥導(dǎo)致的復(fù)發(fā)是乳腺癌患者死亡的主要原因[3]。因此研究乳腺癌惡性進展的分子機制以探索新的治療途徑，對改善患者的生存期和生存質(zhì)量均具有重大的意義。G蛋白偶聯(lián)受體激酶5(GRK5)位于10q26.11染色體上，廣泛分布在多種類型細胞中，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，具有重要的生理功能。GRK5表達異常涉及多種疾病過程，包括糖尿病、動脈粥樣硬化和帕金森病等[4～6]。GRK5在腎透明細胞癌、非小細胞肺癌和前列腺癌等腫瘤中同樣發(fā)揮重要作用，與腫瘤增殖、侵襲和耐藥等密切相關(guān)，可促進腫瘤的惡性進展，可能是腫瘤治療的潛在靶點[7～9]。同時，研究發(fā)現(xiàn)GRK5與乳腺癌細胞對紫杉醇化療敏感性增加有關(guān)[10]。因此2017年10月～2019年6月本研究探討了GRK5對乳腺癌細胞增殖、遷移、凋亡和紫杉醇化療敏感性的影響，并初步探討其發(fā)揮作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌細胞系MDA-MB-435S購于美國ATCC細胞庫；培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、6孔板和96孔板等購于美國Coring公司；L-15和FBS購于美國Gibco公司；GRK5 siRNA購于上海銳博生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑購自北京東仁化學(xué)科技有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司；強效RIPA裂解液購于北京索萊寶公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購于美國Thermo公司；PVDF膜購于美國Promega公司；GRK5、P53、MDM2和GAPDH抗體購自英國Abcam公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Millipore公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染 MDA-MB-435S細胞復(fù)蘇后重懸于含有10% FBS的L-15培養(yǎng)基中，放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度為95%左右時，以2.0×105個/孔接種于6孔板中，分為si-NC組和si-GRK5組，細胞接種12 h后采用脂質(zhì)體2000按說明書進行各組轉(zhuǎn)染，NC siRNA與脂質(zhì)體2000混合后加至si-NC組細胞中進行轉(zhuǎn)染，GRK5 siRNA與脂質(zhì)體2000混合后加至si-GRK5組細胞中進行轉(zhuǎn)染。6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，進行后續(xù)實驗的研究。

1.3 細胞GRK5蛋白檢測 采用Western blotting法。收集兩組轉(zhuǎn)染48 h的MDA-MB-435S細胞，加入RIPA裂解液完全裂解后，離心去除細胞碎片。將上清液移至新的EP管中，BCA檢測蛋白濃度。蛋白裂解液中加入上樣緩沖液進行煮沸變性，SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)，封閉液室溫孵育1 h后，加入GRK5一抗稀釋液4 ℃孵育過夜。TBST洗3次，二抗稀釋液室溫孵育2 h。采用ECL試劑盒曝光條帶。采用Image J軟件測量GRK5蛋白條帶灰度值，計算目的條帶的相對表達量(目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值)。

1.4 細胞增殖能力測算 采用CCK-8實驗。將si-NC組和si-GRK5細胞按1 000個/孔接種于96孔板中，各組設(shè)置6個復(fù)孔。分別在轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h時，每孔加入10 μL的CCK-8試劑。細胞培養(yǎng)箱孵育1 h后，酶標(biāo)儀檢測各組細胞在450 nm波長處的光密度(OD)值，以O(shè)D值代表細胞增殖能力。

1.5 細胞遷移能力觀察 采用劃痕實驗。將si-NC組和si-GRK5組細胞按4×105個/孔接種于6孔板中，各組設(shè)置3個復(fù)孔。待細胞融合度為98%左右時，用劃痕器在6孔板正中間垂直劃一條劃痕，洗去脫落的細胞，顯微鏡下觀察劃痕寬度，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后顯微鏡下觀察劃痕寬度變化。劃痕愈合比=1-(24 h劃痕寬度/0 h劃痕寬度)%。劃痕愈合比代表細胞的遷移能力，即劃痕愈合比越大，其遷移能力越強。

1.6 細胞凋亡率測算 無EDTA胰酶消化收集si-NC組和si-GRK5組轉(zhuǎn)染48 h的細胞，PBS洗3次后，按照細胞凋亡染色試劑盒說明書進行細胞染色，每管細胞為5×105個，每組有3個復(fù)孔，染色后采用流式細胞儀進行細胞凋亡率檢測。

1.7 細胞紫杉醇化療敏感性觀察 采用CCK-8實驗。將si-NC組和si-GRK5組細胞按2 000個/孔接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在接種12 h細胞貼壁后，分別加入不同濃度(0、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μg/mL)的紫杉醇處理細胞48 h，每組設(shè)置6個復(fù)孔。每孔加入10 μL的CCK-8試劑，細胞培養(yǎng)箱孵育1 h后，酶標(biāo)儀檢測各組細胞在450 nm波長處的OD值。細胞生長存活率=(各加藥組OD值/各不加藥組OD值)，計算紫杉醇作用MDA-MB-435S細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.8 細胞P53、MDM2和MMP2蛋白檢測 參照1.3。

2 結(jié)果

2.1 兩組GRK5蛋白表達比較 si-NC組、si-GRK5組GRK5蛋白的相對表達量分別為0.74±0.08、0.25±0.03，兩組比較P<0.05。

2.2 兩組細胞增殖能力比較 見表1。

表1 兩組細胞增殖能力比較

2.3 兩組細胞遷移能力比較 si-NC組、si-GRK5組細胞劃痕愈合比分別為(22.64±9.05)%、(6.25±2.02)%,兩組比較P<0.05。

2.4 兩組細胞凋亡率比較 si-NC組、si-GRK5組細胞凋亡率分別為(9.24±2.57)%、(21.64±8.51)%,兩組比較P<0.05。

2.5 兩組紫杉醇化療敏感性比較 0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μg/mL紫杉醇處理si-NC組細胞生長存活率分別為(100±1.25)%、(98.36±4.23)%、(93.51±5.36)%、(88.24±7.98)%、(81.62±10.35)%、(74.26±9.20)%、(61.60±3.24)%、(50.95±6.24)%、(39.11±6.95)%、(28.42±0.95)%，si-GRK5組分別為(100±0.46)%、(94.12±5.01)%、(80.32±3.25)%、(79.04±10.09)%、(62.41±2.62)%、(51.64±9.42)%、(42.54±3.51)%、(30.16±9.51)%、(14.25±3.01)%、(6.21±1.04)%。紫杉醇對si-NC組、si-GRK5組的IC50值分別為16.22±2.54、7.43±1.25，兩組比較P<0.05。

2.6 兩組P53、MDM2、MMP2蛋白表達比較 si-NC組P53、MDM2、MMP2蛋白相對表達量分別為1.00±0.03、1.00±0.04、1.00±0.02，si-GRK5組分別為7.41±0.73、0.18±0.03、0.36±0.05，兩組比較P均<0.05。

3 討論

乳腺癌是女性中最常見的癌癥，在全世界范圍內(nèi)具有高發(fā)病率和病死率[1]。傳統(tǒng)的治療策略(包括手術(shù)、放療或化學(xué)療法)已被廣泛用于乳腺癌患者，其中紫杉醇等藥物是治療乳腺癌的一線化療藥物。乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病，具有不同的病理和分子特征，這使得大部分患者后期對化療藥物產(chǎn)生耐藥[3]。目前除了傳統(tǒng)治療方法以外，對于激素依賴性的乳腺癌患者可采用激素療法，以及對于具有已知藥物靶點的乳腺癌患者進行靶向分子治療。靶向治療是針對腫瘤細胞的高度特異性的新型治療方法，不良反應(yīng)較小，但是大部分乳腺癌患者不表達激素受體和不具有已知藥物的分子靶點，以及存在化療和靶向藥物的耐藥，使得乳腺癌患者預(yù)后仍然不盡人意[11]。尋找可靠有效的治療靶標(biāo)解決乳腺癌耐藥和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為是目前的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。

GRK屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，可以識別和磷酸化抑制包括腎上腺素能、毒蕈堿、多巴胺和趨化因子受體等G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)，從而導(dǎo)致它們的脫敏作用[12]。多項研究表明，在腫瘤等多種病理狀況下，GRKs的表達和活性均受到損害。目前已鑒定出7種GRK的亞型(GRK1～7)，其中GRK5是一種多功能蛋白，能夠響應(yīng)各種刺激而在細胞內(nèi)移動，從而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)關(guān)鍵信號，從細胞膜上的受體激活到細胞核中的基因轉(zhuǎn)錄。研究[13]報道，GRK5能夠通過使GPCRs和非GPCRs受體脫敏來抑制癌癥進展，并誘導(dǎo)腫瘤生長。GRK5在多種腫瘤中高表達，促進腫瘤的生物學(xué)行為，Zhao等[7]報道，與配對的相鄰非腫瘤組織相比，腎細胞癌組織具有更高的GRK5表達，并與患者不良預(yù)后有關(guān)，敲低GRK5降低腎細胞癌細胞系的活力、侵襲和遷移能力，誘導(dǎo)細胞周期阻滯在G1期。GRK5在非小細胞肺癌癌組織中同樣表達增加，耗竭GRK5可以抑制腫瘤癌細胞的增殖、體外遷移和體內(nèi)異種移植腫瘤形成的能力，并誘導(dǎo)細胞凋亡和細胞周期阻滯在G2/M期[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與si-NC組相比，si-GRK5組乳腺癌細胞增殖和遷移的能力降低，細胞凋亡率升高。表明GRK5在乳腺癌中發(fā)揮癌基因作用，與在腎細胞癌和非小細胞肺癌中的研究一致[7,8]。Lagman等[10]研究報道，乳腺癌MDA-MB-231細胞中GRK5表達降低，對紫杉醇凋亡效應(yīng)的敏感性增加。紫杉醇在臨床上是治療轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)乳腺癌患者的一線化療藥物，但是腫瘤細胞對其具有較高的耐藥性[14]。本文同樣發(fā)現(xiàn)，干擾GRK5的表達，乳腺癌細胞MDA-MB-435S對紫杉醇的敏感性增加。GRK5促進乳腺癌的進展，但是發(fā)揮的作用機制需進一步研究。目前提示GRK5促進腫瘤發(fā)生的證據(jù)是其抑制P53的表達[13]。P53是一種重要的腫瘤抑制因子，可誘導(dǎo)細胞周期停滯或凋亡，P53與其抑制因子E3泛素連接酶MDM2形成的P53/MDM2密切調(diào)控腫瘤的增殖和凋亡及依賴凋亡途徑的耐藥作用[15]。此外，MMP2是通過降解細胞外基質(zhì)促進腫瘤侵襲遷移的重要蛋白[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與si-NC組相比，si-GRK5組細胞中P53蛋白表達增加，MDM2和MMP2蛋白表達降低，表明GRK5通過調(diào)控P53/MDM2信號通路促進MMP2的表達參與乳腺癌的惡性進展。

綜上所述，干擾GRK5的表達可抑制乳腺癌細胞增殖、遷移能力，促進細胞凋亡發(fā)生和對紫杉醇的敏感性，這可能是通過調(diào)控P53/MDM2信號通路的激活和MMP2蛋白的表達實現(xiàn)的。