骨肉瘤組織中IMP3表達及MVD與患者臨床病理特征的關系

周偉，陳敬有，魏優秀，李賀偉

華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院，武漢 430000

骨肉瘤是一種發病率較高的原發性惡性腫瘤，好發于青少年，惡性程度高，起病早期即可發生血行轉移，致殘率與致死率均處于較高水平[1]。骨肉瘤的發生、轉移、復發具有多階段的特性，是多因素相互作用的結果，其具體機制目前尚未完全明確[2]。胰島素樣生長因子Ⅱ mRNA結合蛋白3(IMP3)是一種新發現的癌癥相關蛋白，生理情況下表達于胚胎組織中，罕見于成年機體的正常組織，但當成年機體的細胞發生癌變時，會由于去分化現象而重新分泌胚胎時期特有的蛋白，因此IMP3被發現表達于多種腫瘤組織中[3]。微血管密度(MVD)可以定量地反映血管生長情況，因此通常被認為是血管生成強度最重要的指標之一[4]。目前臨床上對于MVD值的檢測以CD34、CD31等血管內皮細胞標記物的表達為主要手段[5]，本研究選擇在血管中表達較為廣泛的CD34為標記物。本研究采用SP免疫組化法檢測骨肉瘤組織中IMP3、MVD的表達，探討IMP3、MVD在骨肉瘤的發生與惡性進展過程中的作用，并預測其成為骨肉瘤相關腫瘤標記物的可能性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月～2019年12月本院收治的骨肉瘤患者70例，其中男42例、女28例，年齡9～39歲；<18歲29例，≥18歲41例；腫瘤直徑<5 cm者29例，≥5 cm者41例；病變部位：股骨20例，脛骨19例，肱骨12例，其他19例；Enneking分期Ⅰ期17例，Ⅱ期27例，Ⅲ期26例；39例未發現肺轉移，31例出現肺轉移。納入標準：經病理確診為原發性骨肉瘤；患者臨床病歷資料完整，存檔蠟塊組織保存完好；術前未經其他抗腫瘤治療；未合并其他影響免疫組化結果的疾病。

1.2 骨肉瘤組織中IMP3表達、MVD檢測

1.2.1 免疫組化染色 本研究中，IMP3檢測所用一抗為兔抗人IMP3多克隆抗體；MVD檢測以CD34標記，一抗為兔抗CD34多克隆抗體；試劑均購自美國Santa公司。SP通用免疫試劑盒購自深圳子科生物科技有限公司。以PBS作為陰性對照一抗。將存檔蠟塊標本以4 μm為間隔，連續切片，常規二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化。于95 ℃修復抗原15 min，加入3%雙氧水以消除內源性過氧化物酶活性。加入一抗，于4 ℃孵育過夜。加入羊抗兔IgG工作液，37 ℃孵育30 min。滴加鏈霉親和素工作液，37 ℃孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復染。常規脫水，制片，封片。

1.2.2 結果判定 本研究染色結果判定均由兩位病理科高年資醫師獨立判定。若兩位醫師意見相左，則報請病理科主任判定，若仍不能確定結果則排除該病例。

IMP3陽性染色定位于細胞質，采用半定量法判定，于高倍(×400)光學顯微鏡下，取6個陽性細胞較多的視野，每個視野細胞數不少于100個，最終結果取各視野結果的算術平均數。將染色結果分為程度計分(無著色計0分，淡黃色至黃色計1分，棕黃色計2分，褐色計3分)與數目計分(染色細胞<5%計0分，5～30%計1分，>30～60%計2分，>60%計3分)。將兩項計分相乘作為染色總結果，≤1為陰性、>1為陽性。

MVD染色先于低倍(×40)光學顯微鏡下瀏覽切片，找尋血管密集、染色對比度較高的區域，再于高倍(×400)光學顯微鏡下計算血管數目。依照Weidner法[6]，將棕色染色的單個血管內皮細胞或內皮細胞束視為一個微血管數，但厚平滑肌層或管腔切面面積>8個紅細胞直徑的血管不計入。取6個不同視野，MVD值為6個視野的算數平均數。

2 結果

2.1 骨肉瘤和癌旁組織中IMP3表達、MVD比較 IMP3在骨肉瘤組織中陰性7例、陽性63例，癌旁組織中陰性43例、陽性27例，骨肉瘤組織中IMP3的表達高于癌旁組織(P<0.05)。骨肉瘤和癌旁組織MVD值分別為55.97±9.64、48.02±3.93，骨肉瘤組織MVD值高于癌旁組織(P<0.05)。

2.2 骨肉瘤組織中IMP3表達和MVD與患者臨床病理參數的關系 骨肉瘤組織中，IMP3的表達與性別、年齡、病變部位無關(P均>0.05)，而與腫瘤直徑、Enneking分期、肺轉移有關(P均<0.05)；MVD值與性別、年齡、病變部位無關(P均>0.05)，而與腫瘤直徑、Enneking分期、肺轉移有關(P均<0.05)。見表1。

2.3 骨肉瘤組織中IMP3表達和MVD的關系 IMP3在骨肉瘤組織中陰性7例、陽性63例，MVD值分別為45.11±7.62、57.19±9.09，骨肉瘤組織中IMP3和MVD的表達呈正相關(r=0.493，P=0.001)。

3 討論

隨著現代醫學的發展，骨肉瘤的治療方法由單純的外科治療，轉變為保肢治療為主結合新輔助化療、外科治療、放療等手段的綜合診療方案[7,8]，患者的5年生存率因此從不足20%上升至60%～70%[9,10]，保肢率可達90%以上[11]。但近來患者的5年生存率改善遇到瓶頸，骨肉瘤對患者及其家屬造成的精神及經濟壓力并沒有得到滿意的改善。尋找特異性高的骨肉瘤標記物，建立敏感的早期診斷檢測方案，進一步深入研究骨肉瘤的發生、惡性進展的機制，以尋求治療方法的突破是臨床上迫切的需求。

表1 骨肉瘤組織中IMP3表達、MVD與患者臨床病理參數的關系

IMP3最初被稱為“癌癥中過表達的K同源區控制蛋白”[3]，定位于染色體7p11.5，長度約64 kD。IMP3能與胰島素樣生長因子(IGF)Ⅱ mRNA的5′非翻譯區結合，從而調節IGF Ⅱ mRNA的定位、翻譯及反轉錄作用[12,13]。IMP3在許多惡性腫瘤組織中均有表達，是近來研究的熱點之一。Yan等[14]發現，IMP3在非腫瘤肺組織中未見陽性表達，但在肺腺癌組織中陽性表達率上升至41.1%，且IMP3陽性表達的肺腺癌組織的惡性程度較高；El-Balat等[15]發現，IMP3僅在原發性卵巢交界性腫瘤中呈陽性表達，而在其他病理類型的卵巢組織中未見表達；Elshafey等[16]則證實，IMP3在涎腺黏液表皮樣癌中異常高表達，且與多種臨床病理參數密切相關，但在其他類型的表皮樣癌中未見表達，是一種極具潛力的早期診斷、預后評估指標。本研究結果中，IMP3在骨肉瘤組織中的陽性表達率較癌旁組織高，由此可以推斷IMP3與骨肉瘤的發生相關。進一步研究發現，骨肉瘤組織中IMP3的表達與腫瘤直徑、Enneking分期、肺轉移等反映腫瘤惡性程度的臨床病理參數有關，因此可以將IMP3視作與骨肉瘤的惡性程度相關，與前述IMP3在其他惡性腫瘤中的表現類似。

MVD值用免疫組化法標記腫瘤組織內微血管，后依據不同標準所計算出的單位面積中微血管的數目。MVD值能夠較為直觀地表現腫瘤組織的血管形成能力，被認為是目前能夠反映腫瘤組織中血管生存活性的重要指標[17]。而微血管的生成是腫瘤侵襲、轉移的重要步驟之一，與腫瘤的惡性程度密切相關。Yang等[18]通過對肝細胞癌的臨床研究發現，CD34標記的MVD值與腫瘤的大小、淋巴結轉移等參數有關，且是肝細胞癌患者預后的獨立影響因素；田墨涵等[19]則發現CD34標記的MVD值在結直腸癌組織中升高，且與結直腸癌的TNM分期、血行轉移相關。本研究同樣選擇檢測CD34標記的MVD值，SP免疫組化染色結果顯示，骨肉瘤組織的MVD值高于癌旁組織，因此骨肉瘤組織中微血管的生存能力高于癌旁組織。進一步研究發現，骨肉瘤組織中MVD值與腫瘤直徑、Enneking分期等反映腫瘤惡性程度的臨床病理參數有關，且發生肺轉移的骨肉瘤患者MVD值較未轉移者高，差異具有統計學意義。可見MVD值能在一定程度上反映骨肉瘤的惡性程度。

張亞軍等[20]發現，子宮頸鱗狀細胞癌組織中IMP3與CD34標記的MVD值均上升，且與腫瘤的惡性程度有關，IMP3的表達與MVD值呈正相關。本研究結果顯示，骨肉瘤組織中IMP3的表達與MVD值同樣呈正相關。骨肉瘤中IMP3與MVD的作用可能與其在子宮頸鱗狀細胞癌中的作用相類似，同樣參與惡性腫瘤的發生，并在腫瘤的浸潤、轉移等惡性進展中起促進作用。

綜上所述，骨肉瘤組織中IMP3表達、MVD異常上調，且與腫瘤的惡性程度密切相關。骨肉瘤組織中IMP3、MVD可能參與骨肉瘤的發生、發展。聯合檢測IMP3、MVD的表達有可能成為骨肉瘤早期鑒別診斷、治療方案制定相關的生物標記物。