細(xì)胞色素P450 2C19基因多態(tài)性對(duì)NSTE-ACS患者血小板反應(yīng)性及臨床預(yù)后的影響

張瑩瑩，鄭君毅，劉婷，張瑩，馬靜，劉寅

天津市胸科醫(yī)院，天津市心血管病研究所，天津 300222

急性冠脈綜合征(ACS)并發(fā)癥多，病死率高，非ST段抬高急性冠脈綜合征(NSTE-ACS)為其中的重要類型，其病理機(jī)制為富血小板血栓完全或部分阻塞冠脈，因此有效的抗血小板治療尤為重要。阿司匹林聯(lián)合血小板P2Y12受體拮抗劑的雙聯(lián)抗血小板治療(DAPT)在心血管疾病的抗栓治療中發(fā)揮重要作用。但氯吡格雷抵抗和治療后血小板高反應(yīng)(HTPR)不斷被報(bào)道[1]。氯吡格雷抵抗患者PCI術(shù)后支架內(nèi)血栓的風(fēng)險(xiǎn)性增加[2,3]，本課題前期研究也有類似發(fā)現(xiàn)[4]。因此如何早期識(shí)別氯吡格雷抵抗患者，降低血栓事件的發(fā)生，一直為研究的熱點(diǎn)。許多因素被報(bào)道與氯吡格雷抵抗有關(guān)，細(xì)胞色素P450 2C19(CYP2C19)基因多態(tài)性也多次被證實(shí)與之相關(guān)[5～7]。其中CYP2C19*1等位基因是一種正常活性等位基因，即野生型，*2和*3等位基因是亞洲人群中最為常見的兩種功能缺失等位基因。功能缺失等位基因攜帶是否與氯吡格雷抵抗甚至是HTPR相關(guān)，是否影響ACS患者的預(yù)后仍存在爭(zhēng)議[8]。因此本研究觀察了CYP2C19基因多態(tài)性對(duì)NSTE-ACS患者血小板反應(yīng)性及臨床預(yù)后影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 連續(xù)納入2017年8～12月于天津市胸科醫(yī)院住院治療的462例NSTE-ACS患者。NSTE-ACS診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2012年我國(guó)《非ST段抬高急性冠脈綜合征診斷和治療指南》[9]。其中男238例、女224例，年齡31～79(58.5±9.0)歲。根據(jù)CYP2C19基因型不同，分為快代謝型、中間代謝型和慢代謝型。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝腎功能嚴(yán)重不良者，合并其他終末期疾病，預(yù)期壽命小于1年者；先天性心臟病、心臟瓣膜病、嚴(yán)重充血性心力衰竭者；已行PCI或冠脈旁路移植術(shù)者；入院前服用過(guò)氯吡格雷等抗血小板藥物，或注射過(guò)普通肝素/低分子肝素等藥物者；周圍血管疾病或周圍血管栓塞性疾病者；急性感染、免疫性疾病、腦血管疾病及腫瘤者；血液系統(tǒng)疾病，近期有出血傾向者和有潛在出血危險(xiǎn)者(血小板計(jì)數(shù)<150×109/L或>450×109/L、血紅蛋白<80 g/L)；應(yīng)用炎癥抑制藥物如非甾體類抗炎藥、類固醇及阿片類藥物者。本研究經(jīng)天津市胸科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情同意。

1.2 一般資料收集 采集患者基本資料，包括性別、年齡、身高、體質(zhì)量、高血壓史、糖尿病史、吸煙史、飲酒史等。患者于采血前24 h口服氯吡格雷300 mg和阿司匹林300 mg，常規(guī)檢測(cè)血常規(guī)[白細(xì)胞(WBC)、中性粒細(xì)胞百分比(N%)、淋巴細(xì)胞百分比(L%)、血紅蛋白(Hb)、血小板(PLT)]、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、肌酐(Cr)、尿素氮、尿酸、同型半胱氨酸(Hcy)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、肌鈣蛋白I(TnI)等生化指標(biāo)。

1.3 血小板活性測(cè)定 通過(guò)兩種方法評(píng)價(jià)服用氯吡格雷后血小板的活性。①流式細(xì)胞術(shù)。采用流式細(xì)胞儀(Beckman Cytomics FC500 MCL，美國(guó))、VASP檢測(cè)試劑盒(PLT VASP/P2Y12,BIOCYTEX,法國(guó))，于48 h內(nèi)按說(shuō)明書對(duì)標(biāo)本進(jìn)行操作完成檢測(cè)。測(cè)定血小板血管擴(kuò)張刺激磷酸蛋白(VASP)磷酸化水平，計(jì)算血小板反應(yīng)指數(shù)(PRI)。②光比濁法血小板聚集試驗(yàn)(LTA)。采用血小板聚集儀(CHRONO-LOG Whole-Blood Aggregometer,美國(guó))、ADP(CHRONO-PAR ADP,美國(guó))，按說(shuō)明書操作，計(jì)算血小板聚集率(PAG)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 CYP2C19基因型鑒定 采用Genomic DNA Purification Kit(Promega)試劑盒按說(shuō)明書提取人基因組DNA。使用Primer 6引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，CYP2C19*2突變(m1型突變)引物序列：5′-AATTACAACCAGAGCTTGGC-3′，5′-TATCACTTTCCATAAAAGCAAG-3′。CYP2C19*3突變(m2型突變)，引物序列：5′- TGTGCTCCCTGCAATGTGAT-3′，5′-TTTGGGGCTGTCACCAAAGT-3′。PCR產(chǎn)物分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶QuickCut SmaⅠ(TaKaRa)、QuickCut BamHⅠ(TaKaRa)消化酶切。酶切后的產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析。突變型因失去限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，不能被酶切，因此產(chǎn)生的條帶數(shù)不同，不含有功能缺失等位基因?yàn)榭齑x型(CYP2C19*1/*1)、包含1個(gè)功能缺失等位基因?yàn)橹虚g代謝型(CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3)，包含2個(gè)功能缺失等位基因?yàn)槁x型(CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3)。

1.5 隨訪 全部患者于PCI術(shù)后1、3、6、12、18、24月進(jìn)行電話或門診隨訪，再發(fā)心絞痛或急性心梗患者進(jìn)行冠脈造影復(fù)查。以全因死亡、支架內(nèi)再狹窄、急性PCI內(nèi)血栓形成、再發(fā)急性心肌梗死定義為主要不良心血管事件(MACE)。

2 結(jié)果

快代謝型158例、中間代謝型246例、慢代謝型58例。

2.1 CYP2C19不同基因型一般資料比較 見表1。

表1 CYP2C19不同基因型一般資料比較

2.2 CYP2C19不同基因型血小板活性比較 快代謝型、中間代謝型、慢代謝型PRI分別為48.6±10.5、56.7±12.6、65.3±11.4，PAG分別為67.4±8.5、71.9±8.2、78.4±6.1，三者兩兩比較P均<0.01。

2.3 CYP2C19不同基因型臨床預(yù)后比較 462例NSTE-ACS患者均按要求完成隨訪，53例(11.5%)患者發(fā)生復(fù)合終點(diǎn)事件，其中死亡3例(0.6%)，急性心梗再入院8例(1.7%)，經(jīng)冠脈造影復(fù)查發(fā)現(xiàn)支架內(nèi)再狹窄(狹窄程度>50%)42例(9.1%)。快代謝型、中間代謝型、慢代謝型MACE發(fā)生率分別為2.5%、9.8%、43.1%，三者兩兩比較P均<0.01。通過(guò)Cox回歸模型對(duì)MACE進(jìn)行生存分析，發(fā)生MACE定義為狀態(tài)變量(發(fā)生MACE事件賦值為1，未發(fā)生者賦值為0)，基因型、PRI、PAG、性別、年齡、糖尿病史、吸煙史、飲酒史為協(xié)變量(快代謝型賦值為3、中間代謝型賦值為2、慢代謝型賦值為1；男性、糖尿病、吸煙、飲酒賦值為1；女性、無(wú)糖尿病、不吸煙、不飲酒賦值為0)，同時(shí)代入復(fù)合終點(diǎn)事件發(fā)生的時(shí)間，結(jié)果顯示PRI(HR：1.05,95%CI：1.03～1.07，P<0.01)和基因型(HR：1.84，95%CI：1.09～3.12，P=0.02)為MACE的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(見表2)。

表2 NSTE-ACS患者發(fā)生MACE的Cox回歸分析

3 討論

抗血小板藥物氯吡格雷為無(wú)活性的前體藥物，需經(jīng)過(guò)肝臟細(xì)胞色素P450酶代謝轉(zhuǎn)化后才能發(fā)揮抗血小板活性，而CYP2C19為其中的限速酶，CYP2C19基因突變損失代謝活性，勢(shì)必影響氯吡格雷的體內(nèi)激活。大量觀察性研究表明，CYP2C19功能缺失等位基因攜帶與缺血性心血管事件增加有關(guān)[2,3,10]。因此本研究根據(jù)功能缺失等位基因攜帶的多少將患者分組，入組患者為接受PCI治療的NSTE-ACS患者。其中CYP2C19*1等位基因最為普遍，是一種正常的活性等位基因，即野生型。CYP2C19*2～*8等位基因?yàn)楣δ苋笔У任换颍瑸橥蛔冃汀Ｆ渲蠧YP2C19*2是最常見的功能缺失等位基因[11]。在東亞人群中，*2和*3的頻率遠(yuǎn)高于歐洲和非洲血統(tǒng)人群[12]，據(jù)報(bào)道，*2的等位基因頻率在白種人和非洲人中約為15%，在亞洲人中為25%～35%[12～14]。*3～*8等位基因在歐洲和非洲血統(tǒng)人群中頻率較低(低于1%)。CYP2C19*3等位基因在東亞人群中較為常見(5%～15%)，考慮到該基因多態(tài)性的民族、種族差異，本研究檢測(cè)了在亞洲人群中最為常見的兩種CYP2C19功能缺失等位基因進(jìn)行研究。結(jié)果顯示慢代謝型PRI及PAG均高于快代謝型、中間代謝型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示CYP2C19基因型與氯吡格雷抵抗及HTPR相關(guān)。另一項(xiàng)相關(guān)研究報(bào)道，CYP2C19功能缺失等位基因的攜帶者與非攜帶者相比，氯吡格雷活性代謝物的形成減少了32.4%，血小板聚集率絕對(duì)值下降減少了9%(相對(duì)值減少約25%)[15]。這項(xiàng)研究的結(jié)論間接為本研究提供了合理的解釋。另有研究報(bào)道,CYP2C19功能缺失等位基因的雜合子(如*1/*2和*1/*3)對(duì)氯吡格雷的反應(yīng)介于*1等位基因的純合子和功能缺失等位基因的純合子或復(fù)合雜合子(如*2/*2和*2/*3)之間[15～17]。與本研究結(jié)果類似，即攜帶功能缺失等位基因越多，激活氯吡格雷的能力也越差，PRI或PAG也相應(yīng)的增高。

一項(xiàng)薈萃分析納入9 865例接受氯吡格雷治療的患者(54.5%為ACS、91.3%為PCI)，發(fā)現(xiàn)即使攜帶一個(gè)CYP2C19功能缺失等位基因也會(huì)導(dǎo)致不良的預(yù)后，尤其是支架內(nèi)血栓形成[6]。本研究全部納入接受PCI治療NSTE-ACS患者，Cox回歸分析顯示CYP2C19基因型與患者不良心血管預(yù)后獨(dú)立相關(guān)，與以上研究結(jié)果類似。當(dāng)然仍有相當(dāng)?shù)难芯坎⑽吹玫揭恢滦缘慕Y(jié)論。另一項(xiàng)薈萃分析共納入32項(xiàng)研究42 016例低風(fēng)險(xiǎn)患者(如冠心病穩(wěn)定患者、ACS內(nèi)科治療患者或房顫患者)，結(jié)果顯示攜帶一個(gè)或更多CYP2C19等位基因與不良結(jié)果之間沒(méi)有顯著相關(guān)性[8]。這些相互矛盾的結(jié)果可能歸因于患者的基線特征不同，一組為高風(fēng)險(xiǎn)患者，另一組為低風(fēng)險(xiǎn)患者。考慮到人群的差異可能對(duì)結(jié)論的影響，本課題納入的人群均為高危人群(NSTE-ACS患者并接受PCI治療)。一項(xiàng)關(guān)于CYP2C19基因分型的薈萃分析[18](包括對(duì)36 076例參與者的24項(xiàng)研究)得出了一個(gè)有趣的結(jié)果，該研究根據(jù)使用氯吡格雷的適應(yīng)證和種族(如是否PCI，亞洲還是歐洲人)具體分析，顯示CYP2C19功能缺失等位基因的存在僅在因PCI適應(yīng)證而使用氯吡格雷的患者中與不良結(jié)果相關(guān)。在白人患者中，這一關(guān)聯(lián)微弱(RR：1.20,95%CI：1.10～1.31)，而在亞洲患者中，這一關(guān)聯(lián)更為強(qiáng)烈(RR：1.91,95%CI：1.61～2.27)，這一結(jié)果與本研究結(jié)論相似。本研究顯示CYP2C19基因型預(yù)測(cè)MACE的HR為1.84(95%CI:1.09～3.12)。因此，CYP2C19功能缺失等位基因在臨床上主要在高危亞群(如PCI或ACS)具有重要意義，而在慢性穩(wěn)定性心絞痛患者或有房顫等其他適應(yīng)證的患者中，其基因型差異與不良事件的關(guān)系似乎不顯著[19～21]。

可見，CYP2C19功能缺失等位基因與HTPR和氯吡格雷抵抗相關(guān)，并增加不良心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)，慢代謝型可作為NSTE-ACS患者預(yù)后不良的預(yù)測(cè)指標(biāo)，但由于入組人群的限制，缺乏低危的慢性穩(wěn)定性心絞痛患者或有其他適應(yīng)證患者的研究數(shù)據(jù)。因此，在臨床研究中對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)(ACS、PCI)患者，更應(yīng)關(guān)注其CYP2C19基因型及血小板功能，早期鎖定氯吡格雷抵抗患者，盡早干預(yù)，預(yù)防不良心血管事件的發(fā)生。對(duì)于快代謝型患者,更換新型P2Y12受體拮抗劑可能是更好的選擇，但新型P2Y12受體拮抗劑的應(yīng)用是否能進(jìn)一步降低快代謝型患者PRI及缺血并發(fā)癥仍有待進(jìn)一步研究。