頭腹針療法對氣虛質缺血性中風大鼠干預機制研究*

周海純，韓曉慶，郭蕊珠，蔡國鋒,4△

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院哈南分院，黑龍江 哈爾濱 150001； 2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；3.哈爾濱市急救中心，黑龍江 哈爾濱 150001; 4.黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036)

中風具有很高的致殘率，嚴重影響了個人生活，并且在一定程度上阻礙社會經濟的發展。近年來，大量學者對中風病深入研究，筆者查閱大量文獻，經過系統研究，發現中風病9種體質治病原因，歷經10余年對其進行大量研究，依據神經元再生理論，探討中風后神經干細胞變化。大量文獻及研究記載針刺治療中風病效果顯著[1]。依據中醫理論，針刺可以刺激腧穴，疏通經絡，提高人體調整能力，從而使人體最大限度的接近陰陽平衡的平和質狀態，激發自身潛能，修復中風損傷。近年來已經取得了西醫界廣泛認同，研究證實針刺能夠有效的調動內源性保護機制。

頭腹針療法作為針刺療法的一種，由于痛苦小、操作簡便、作用顯著，近年來在臨床普遍應用，在治療中風臨床方面已經有大量學者就其理論機制等進行了大量研究，具有較好的前期研究基礎，驗證了頭腹針療法的治療效果，但查閱文獻發現，其實驗研究內容相對較少，同時對頭腹針療法治療中風的研究很少依據中醫理論采取辨證分型。本實驗研究將頭腹針療法作為治療方法，辨證分型將氣虛質缺血性中風作為研究疾病，參考文獻制備氣虛質缺血性中風大鼠模型，從宏觀神經功能及行為學功能變化、微觀Hes1蛋白、基因變化對神經元再生的影響，探討頭腹針療法治療中風的作用機制，望為頭腹針療法臨床治療氣虛質缺血性中風提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性Wistar大鼠40只，體質量(300±20)g，由哈爾濱醫科大學動物實驗中心提供[動物實驗許可證編號：SCXK(黑)2019-001]。

1.2 主要儀器和試劑

普通光學顯微鏡(Japan OLYMPUS company)；Bio-Rad核酸和蛋白電泳系統(美國 BIO-RAD伯樂公司)；電子嬰兒秤(青島艾訊電子衡器有限公司)；凝膠成像分析儀(無錫百泰克生物科技)；Bio-Rad核酸擴增PCR儀(廣州杰特偉生物科技有限公司)；NanoDrop ND-1000濃度分析儀(Thermo,上海創萌生物科技有限公司)；恒溫水浴鍋(上海一科儀器有限公司);4℃低溫離心機、上海電熱恒溫干燥箱(上海東麓儀器設備有限公司);抗體：兔抗人Hes1多克隆抗體(cam公司，#5702);β-Actin (13E5)Rbit m (CST公司，貨號#4970)等。

1.3 模型制備及篩選方法

實驗造模分為兩個階段，首先所有大鼠進行氣虛質造模，成功后隨機分為模型組、治療組，每組15只模型大鼠，通過MCAO造模，選取合格模型予神經功能及行為學功能評分;另外10只為假手術組，不進行MCAO造模操作。

1.3.1 氣虛質造模 第一步：飲食飲水量控制。鼠糧喂養方式以2 d無喂養與1 d正常喂養交替方式進行，8:30為供給鼠糧時間。飲食量控制參照公式:(供給鼠糧量-剩余鼠糧量)/實驗大鼠數量；飲水量控制參照公式:(供給飲水量-剩余飲水量)/實驗大鼠數量。

第二步：睡眠剝奪。隔日1次將大鼠置于跑臺跑道內，以1 m/min跑臺速度方式制造不穩定平面，每次持續時間24 h，對實驗大鼠睡眠剝奪。每周對實驗大鼠進行記錄1次，記錄內容為體質量、體溫、攝食量、飲水量、抓力，其中對實驗大鼠體溫及抓力的記錄取3次平均值，實驗過程持續時間28 d[2]。

1.3.2 MCAO造模 氣虛質中風大鼠模型成功后，予氣虛質缺血性中風大鼠模型造模，手術方式依據目前公認的Zea Longa等建立的大腦中動脈阻塞術(MCAO) ，對氣虛質中風大鼠實行大腦中動脈內栓線阻斷法建造氣虛質缺血性中風大鼠模型。

1.4 干預方法

1.4.1 模型組 術后不予任何治療。

1.4.2 治療組 采用針刺操作。取穴：頭部采用頭穴叢刺長留針法針刺，依據“大鼠穴位圖譜”選擇頂區及頂前區穴位[3]。腹針療法引氣歸元腧穴取中脘、下脘、氣海和關元。依據大鼠穴位的定位常用“比較解剖取穴法”“模擬骨度法”，在大鼠的腹中線上，以胸劍聯合為定位點，以恥骨聯合上緣為另一定位點，兩者連線的上8/13與下5/13的交點定位為神闕穴;中脘:兩者連線的上4/13與下9/13的交點; 下脘:兩者連線的上6/13與下7/13的交點;關元:兩者連線的上10/13與下3/13的交點;氣海:神闕與關元中點處。

操作：在鼠板上固定氣虛質缺血性中風模型大鼠，選取0．25 mm×15 mm華佗牌無菌針灸針，腹針在中脘、下脘、氣海和關元穴位直刺2 mm，每日1次，每次留針30 min;頭針刺入深度為沿皮平刺大約3 mm，每日1次，每次留針5 h[3]。

1.4.3 假手術組 對實驗大鼠單純動脈剝離即可。

1.5 腦組織取材

將模型組、治療組氣虛質缺血性中風模型剩余大鼠分成3批，分別于針刺3 d、7 d及14 d取材。使用EP管保留標本組織。使用儲存設備選擇-80℃超低溫儀器。

1.6 評價方法

1.6.1 神經功能評定 造模成功24 h后，在療前、療后7 d及療后14 d 3個時間節點對氣虛質缺血性中風大鼠模型評分，并記錄，評分依據為Bederson 4級評分標準[4]。

1.6.2 行為學功能測驗 包括網屏測驗(screentest)、平衡木測驗(balancebeamtest)、抓握-牽引測驗(prehensile-tractiontest)[5]。見表1。

表1 行為學功能評分標準

1.6.3 PCR檢測 引物設計與常規 PCR擴增根據GenBank已發表的大鼠Hes1序列和β-Actin的序列，應用Premier5.0設計引物[6]。見表2。

表2 實驗中所使用的引物序列

1.6.4 Western Blot檢測 Western Blot[7]:第一步：蛋白的膜轉移;第二步：篩選對應抗體;第三步：樣品蛋白檢測。操作：蛋白質膜上轉移;檢測：已知表達蛋白，抗體檢測;檢測：采用融合部分的抗體針對新基因的表達產物進行系統檢測。

2 結果

2.1 各組神經功能評定比較

表3顯示,模型組及治療組均表現神經功能缺損，在治療前模型組與治療組神經功能缺損評分無統計學意義(P>0.05)，說明治療前模型組與治療組氣虛質缺血性中風大鼠模型神經功能缺損程度差異無統計學意義;頭腹針療法治療第7天、第14天后，治療組神經功能評定明顯改善，推斷氣虛質缺血性中風大鼠模型神經元的數量提高,同時模型組氣虛質缺血性中風大鼠神經功能缺損在一定程度上也表現改善，分析原因氣虛質缺血性中風大鼠腦組織自身具有較強的代償修復能力;通過統計學結果可以看出，治療組神經功能評定第7天、第14天與模型組比較差異均具有統計學意義(P<0.05)，說明頭腹針療法治療氣虛質缺血性中風大鼠模型第7天、第14天后，可以有效干預大鼠神經功能狀態。21 d大鼠神經功能恢復，差異無統計學意義。

表3 各組神經功能評定比較

2.2 各組行為學檢查比較

表4顯示,在治療前模型組與治療組氣虛質缺血性中風大鼠模型行為學功能缺損評分比較無統計學意義(P>0.05)，說明治療前模型組與治療組大鼠行為學功能缺損程度差異無統計學意義;頭腹針療法治療第7天、第14天后，治療組行為學明顯改善，推斷氣虛質缺血性中風大鼠模型神經元的數量提高,同時模型組氣虛質缺血性中風大鼠行為學功能缺損在一定程度上也表現改善，分析原因氣虛質缺血性中風大鼠腦組織自身具有較強的代償修復能力;通過統計學結果可以看出，治療組氣虛質缺血性中風大鼠模型行為學功能評定第7天、第14天與模型組比較均具有顯著統計學意義(P<0.01)，說明頭腹針療法治療氣虛質缺血性中風大鼠模型第7天、第14天后，可以有效干預大鼠行為學功能狀態。21 d大鼠行為學功能恢復差異無統計學意義。

表4 各組行為學比較

2.3 各組Hes1 mRNA比較

表5、表6和圖1顯示,神經元及神經膠質細胞中， 假手術組Hes1 mRNA在3 d、7 d和14 d無明顯陽性表達，各時間點陽性表達無統計學意義(P>0.05);模型組Hes1 mRNA在3 d、7 d和14 d具有一定陽性表達，并且14 d陽性表達>7 d陽性表達>3 d陽性表達，說明氣虛質缺血性中風大鼠在腦損傷后具有較強的自我修復能力；治療組Hes1 mRNA陽性表達在3 d、7 d和14 d各時間點均表現明顯，并且14 d陽性表達>7 d陽性表達>3 d陽性表達;治療組Hes1 mRNA陽性表達與模型組比較，在第3天陽性表達差異無統計學意義(P>0.05)，說明頭腹針療法治療對于氣虛質缺血性中風大鼠的腦損傷后Hes1 mRNA表達在第3天可能不具有明顯干預作用;第7天治療組Hes1 mRNA陽性表達與模型組比較差異具有統計學意義(P<0.05)，說明頭腹針療法治療對于氣虛質缺血性中風大鼠腦損傷后Hes1 mRNA表達在連續治療7 d后具有明顯干預作用;第14天治療組Hes1 mRNA陽性表達與模型組比較差異具有顯著統計學意義(P<0.01)，說明頭腹針療法治療對于氣虛質缺血性中風大鼠腦損傷后Hes1 mRNA表達在連續治療14 d具有極明顯干預作用，同時連續治療14 d干預作用優于連續治療7 d。21 d大鼠痊愈，差異無統計學意義，說明大鼠具有很強的自身恢復能力。

表5 Hes1和β-Actin引物設計及驗證

圖1 PCR檢測測定腦組織Hes1 mRNA表達

表6 PCR檢測測定腦組織Hes1 mRNA表達比較

2.4 各組Hes1蛋白比較

表7、圖2顯示,神經元及神經膠質細胞中， 假手術組Hes1蛋白在3 d、7 d和14 d無明顯陽性表達，各時間點陽性表達差異無統計學意義(P>0．05);模型組Hes1蛋白在3 d、7 d未見明顯陽性表達，14 d可以觀測到陽性表達，但很微弱；治療組Hes1蛋白陽性表達在3 d、7 d各時間點均不明顯，僅在14 d可見明顯陽性表達;治療組Hes1蛋白陽性表達與模型組比較，第3天、第7天差異無統計學意義(P>0.05),說明頭腹針療法治療對于氣虛質缺血性中風大鼠的腦損傷后Hes1蛋白表達在第3天、第7天兩個時間點可能不具有明顯干預作用，在第14天治療組Hes1蛋白陽性表達與模型組比較差異具有統計學意義(P<0.05)，說明頭腹針療法治療對于氣虛質缺血性中風大鼠的腦損傷后Hes1蛋白表達在連續治療14 d具有明顯干預作用。21 d大鼠痊愈，差異無統計學意義，說明大鼠具有很強的自身恢復能力。

圖2 腦組織Hes1蛋白表達

表7 腦組織Hes1蛋白表達比較

3 討論

目前研究已經證實Notch信號通路的 “旁側抑制” 作用對神經干細胞分化增殖具有干預作用[8]。Hes 是bHLH基因家族成員之一，是Notch信號的靶基因，在不同時期分別參與祖細胞的分屬及干細胞的分化，其效應物 Hes1通過Notch信號通路抑制神經干細胞分化，促進神經干細胞增殖，因此本實驗選擇Hes1蛋白、基因作為觀測指標，能有效的分析頭腹針療法治療對于氣虛質缺血性中風大鼠在腦損傷后的作用機制[9]。

頭腹針療法治療中風歷史悠久，近代臨床研究明確，經絡學中背為陽、腹為陰，腹部同時有陽經及陰經循行，有陰中之陰的任脈可以調陰，足陽明胃經和足少陽膽經兩條陽經，因此還可以調陽[10]。有帶脈束腰聯絡奇經八脈。人體十二經脈、奇經八脈緊密聯系腹部與全身，同時在現代醫學的不斷深入研究下，腦腸肽理論逐漸得到眾多醫家的重視。腦腸肽是指既存在于胃腸道系統，又存在于腦中的肽類物質的統稱，該發現進一步從生理角度證實了腦與胃腸道之間的聯系。在發現腦腸肽之前，就有醫家發現腸與腦之間存在著聯系并提出了腦腸軸理論。經過研究發現腦腸肽對于腦腸軸的科學運行具有主導作用。腦腸軸的信息主要通過神經系統、內分泌系統、免疫系統和腸道菌群進行傳遞。腦腸軸在大腦和胃腸道之間是一個雙向調節的通路，大腦的活動可以影響胃腸道，胃腸道的功能也可對大腦產生影響。

目前有研究表明胃腸道內的微生物菌群可以通過感染、免疫途徑及內分泌系統參與調節人體的血壓、血糖、血脂，同時腸道菌群代謝產物氧化三甲胺也會影響膽汁酸和膽固醇的代謝，并且能夠使血小板大量聚集從而導致動脈硬化的產生[11]。而動脈硬化又是導致中風的主要原因。同時近年來有研究證實腹部是人類的第二大腦，即腹腦學說及腦腸肽理論。根據孫氏腹針療法理論認為，腹部存在著一個完整的神經系統，其相當于人的第二大腦，腹部是大腦的全息影像[12]。針刺腹部能夠促進或改善大腦的功能。此為頭腹針療法治療主要理論基礎。

本研究結果證實頭腹針療法治療第7天、第14天兩個時間節點，治療組大鼠神經功能及行為學均得到明顯改善，提示頭腹針療法治療可以干預改善氣虛質缺血性中風大鼠模型神經功能及行為學，從而推斷頭腹針療法治療可以促進氣虛質缺血性中風大鼠模型神經元的數量增加。在第14天治療組Hes1 mRNA陽性表達與模型組比較差異具有顯著統計學意義(P<0.01)，治療組Hes1蛋白陽性表達與模型組比較差異具有統計學意義(P<0.05)，說明頭腹針療法治療可以干預氣虛質缺血性中風大鼠腦損傷后Hes1 mRNA及Hes1蛋白表達，提示頭腹針療法治療在一定程度上可以干預氣虛質缺血性中風大鼠腦損傷后神經干細胞的增殖分化。