針刺百會穴對慢性不可預見性溫和應激大鼠糖水消耗和腦代謝組學的影響*

徐雪嬌，范文棟，齊子棠，張 悅，謝 璐，何秀麗，李天英

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

抑郁癥已經成為嚴重影響人類健康的疾病之一，到2020年抑郁癥將成為世界第二大疾病[1-3]。它不僅給患者帶來極大的痛苦，還給家庭和社會帶來沉重的負擔。其治療越來越受到人們的重視，傳統西藥治療副作用大，且易出現耐藥性。針刺治療抑郁癥具有療效好、副作用小的優勢[4 -5],其治療機制尚不清楚。在眾多的抑郁動物模型中，慢性不可預見性溫和應激(Chronic unpredictable mild stress, CUMS)大鼠模型在抑郁癥的研究中頗為常見[6-7]。本實驗選用百會穴，觀察針刺治療抑郁大鼠對糖水消耗的影響，并運用GC-MS(gas chromotography/mass spectrometry)代謝組學平臺，探究針刺治療抑郁癥對中樞代謝水平的影響，挖掘相關代謝通路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

黑龍江中醫藥大學實驗動物中心購入18只雄性SD大鼠。喂養1周后開始適應2%蔗糖水溶液。飼養條件：標準嚙齒動物食水，溫度21～23℃，濕度45%～55%，光照周期12 h。

1.2 實驗流程

如圖1，大鼠適應2%蔗糖水溶液5周后隨機分成CUMS大鼠(12只)和對照組大鼠(6只)，放在不同房間。CUMS大鼠開始進行慢性不可預見性溫和刺激，對照組大鼠不予任何刺激。4周刺激結束后隨機平均分為CUMS組和CUMS+針刺組，隨后CUMS+針刺組開始針刺治療。糖水消耗實驗(Sucrose preference test,SPT)每周固定時間進行。

圖1 實驗流程圖

1.3 CUMS流程

采用經典的CUMS造模方法[8]。具體方法合籠(4～6 h)、空籠(8～12 h)、傾斜鼠籠45°(4～12 h)、濕籠(6～8 h)、夜間光照(12 h)和頻閃(12 h)等方法，每日給予1～2種刺激且相鄰兩天刺激方法不重復。

1.4 行為學

糖水消耗實驗(SPT)測量24 h內2%蔗糖水溶液消耗的百分比。糖水瓶和純水瓶的位置在第12 h交換。

1.5 針刺干預

參考已發表文獻[9]。華佗牌針具(0.18 mm×13 mm，蘇州醫藥有限公司制造)，上午9點，針刺百會穴(GV20，兩耳尖連線中點),消毒后進針5 mm，留針20 min，連續針刺3周。

1.6 取材

7%水合氯醛麻醉大鼠后斷頭取腦，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.7 GC-MS檢測與分析

GC-MS檢測和分析方法基于本研究組已發表的文章[10-11]。

1.7.1 樣品制備 取30 mg樣本加入到1.5 mL離心管中，加入20 μL甲醇配置的0.3 mg/mL內標(L-2-氯-苯丙氨酸)。于-80℃冰箱中放置2 min后研磨(60 Hz，2 min)，超聲提取10 min。-20℃靜置30 min后低溫離心15 min(13 000 rpm，4℃)，取400 μL的上清液，裝入玻璃衍生瓶中。

1.7.2 色譜條件 氣相色譜質譜聯用儀選用Agilent公司的7890A-5975C(Agilent,USA)。衍生化之后采用不分流的方式注入樣品，進樣量1 μL。經毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,Folsom,CA,USA)(HP-5MS)分離后進行質譜檢測。高純度氦氣作為載氣(6.0 mL/min)。升溫程序：60℃→125℃→190℃→210℃→310℃。

1.7.3 質譜條件 離子源溫度：230℃。四極桿溫度：150℃。電子能量：70 eV。全掃描模式(SCAN)范圍：50～600 m/z。

1.8 數據分析

1.8.1 行為學數據統計分析 使用統計軟件SPSS 23.0，采用Studentt檢驗、非參數Mann-WhitneyU檢驗。當P<0.05被認為差異具有統計學意義。

1.8.2 代謝組學數據分析 ChromaTOF(v 4.34,LECO,St Joseph,MI)軟件預處理原始數據，導出的數據矩陣可獲得樣品的基本信息、代謝物名稱、質譜響應強度和內標峰。其中假陽性峰已經除去并去除冗余與峰合并。歸一化質譜峰的響應強度后得到數據矩陣，將其導入SIMCA-P+14.0、Umetrics、Umea、Sweden軟件包。無監督的主成分分析(PCA)用于評估總體分布和穩定性，有監督的(正交)偏最小二乘法分析(O)PLS-DA用來找到組間差異代謝物。循環交互驗證(7次)和排序檢驗(200次)用于評價模型是否存在過度擬合。

2 結果

2.1 針刺百會穴對CUMS大鼠SPT的影響

4周慢性不可預見性溫和刺激后，CUMS大鼠糖水消耗顯著低于對照組大鼠(P<0.01)。針刺治療結束后，針刺大鼠與對照組大鼠糖水消耗差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

注：與對照組比較,**P<0.01。圖2 糖水消耗

2.2 針刺百會穴對CUMS大鼠腦代謝組學影響

圖3為對照組、CUMS組、CUMS+針刺組總離子流圖。如圖4所示，PCA分析得出3組之間能夠區分。OPLS-DA分析能夠將3組明顯區分，表明3組間存在顯著的代謝差異。R2X、R2Y和Q2均是大于零，說明OPLS-DA模型是可靠的。在排列檢驗中，R2與Q2值明顯大于置換的R2與Q2，證明不存在過擬合。OPLS-DA載荷圖鑒定出81種差異代謝物。分析結果表明針刺百會穴治療CUMS大鼠3周后，腦組織中L-同型半胱氨酸和甲氧芐氨嘧啶發生了逆轉。見表1。

圖3 3組總離子流圖

圖4 代謝組學分析

表1 3組腦差異代謝物(對照組與CUMS組具有差異的代謝物)

2.3 代謝通路分析

使用KEGG和HMDB尋找2種逆轉的腦差異代謝物的潛在代謝途徑。MetaboAnalyst 3.0用來確定潛在途徑的影響值。結果顯示，逆轉的差異代謝物主要參與以下兩個代謝途徑：①半胱氨酸、蛋氨酸代謝;②嘧啶代謝。見圖5。代謝途徑如圖6所示。

圖5 使用MetaboAnalyst 3.0進行逆轉代謝物的代謝途徑分析

圖6 針刺治療CUMS大鼠逆轉代謝物(劃線)參與的代謝途徑

3 討論

尋找有效的治療方法是抑郁癥亟待解決的問題。針刺作為傳統治療手段，在抑郁癥的治療中突顯優勢，其治療效果顯著，除疼痛外無明顯副作用[12-14]。有望取代傳統抗抑郁藥物而成為抑郁癥治療的主要手段。百會穴為督脈上的重要穴位，臨床應用十分廣泛，在抑郁癥的治療上起到了十分有效的作用[15-16]。糖水消耗作為評價抑郁癥行為學中的金標準，其在抑郁癥的研究中是不可缺少的[17-18]。在抑郁癥的臨床研究中，腦組織的取材十分困難，本研究采用經典的抑郁癥動物模型——慢性不可預見性溫和應激大鼠，觀察針刺百會穴治療抑郁癥對糖水消耗和腦代謝水平的影響。從行為學到中樞代謝探究針刺治療抑郁癥的理論依據。

經過4周的刺激，CUMS大鼠的糖水消耗值顯著下降，說明模型成功。3周的針刺治療后，CUMS+針刺大鼠的糖水消耗值恢復到正常水平，說明針刺對抑郁樣行為具有逆轉作用。本研究基于GC-MS代謝組學平臺，對CUMS組、CUMS+針刺組和對照組大鼠的腦組織進行檢測分析，結果顯示經過3周針刺治療，CUMS大鼠腦中L-同型半胱氨酸和甲氧芐氨嘧啶水平發生逆轉。氨基酸和嘧啶的代謝紊亂在神經精神疾病中較為常見。同型半胱氨酸是一種在蛋氨酸代謝過程中產生的十分重要的氨基酸。若同型半胱氨酸不轉化為蛋氨酸或半胱氨酸則可以引起神經毒性[19]。Chung等研究表明臺灣地區青少年中抑郁焦慮發病率增高與其血清中半胱氨酸代謝紊亂有關[20]。有研究表明，抑郁癥伴自殺意念合并運動障礙的患者，其同型半胱氨酸的調節大都出現異常[21]。在抑郁癥嘧啶代謝紊亂的相關研究中，本課題組的前期研究結果顯示，雙相情感障礙患者(抑郁相)尿液中尿嘧啶的代謝紊亂[10]。代謝通路分析結果顯示L-同型半胱氨酸和甲氧芐氨嘧啶主要參與半胱氨酸、蛋氨酸代謝和嘧啶代謝。以上結果提示，針刺治療抑郁癥可能是通過調節以上代謝通路完成的。

綜上所述，針刺能夠逆轉抑郁樣行為并調節腦代謝，為針刺治療抑郁癥提供中樞水平的理論依據。下一步，筆者將在針刺治療過程中采集多個時間點數據，研究針刺治療抑郁癥過程中對代謝的調節,為針刺治療抑郁癥代謝水平提供更加全面的數據,為針刺成為抑郁癥的主要治療手段提供理論依據。