電針運動區對大腦中動脈閉塞大鼠腦神經再生機制影響研究*

馬 英,劉 星,王玥琪,楊春壯

(牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157011)

缺血性腦中風是常見的急性腦血管病，一直是基礎和臨床醫學科學研究的重點、難點和熱點。臨床實踐證實頭針能夠改善中風患者的神經功能缺損，促進功能恢復，減輕腦水腫，且取穴精簡、操作簡便、不易誘發肌痙攣，是中醫治療缺血性中風的常用且有效的方法[1]。本研究采用線栓法制作大腦中動脈閉塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型，以電針百會穴透太陽穴為干預措施，觀測針刺后MCAO大鼠大腦海馬內巢蛋白(Nestin)和神經生長因子(NGF)表達的變化規律，從中樞神經功能重建和再生角度，探尋針刺運動區治療缺血性中風的機制。

1 材料

1.1 動物

所采用SPF級SD大鼠由牡丹江醫學院醫藥研究中心提供[實驗動物許可證號:SYXX(黑)2015-007]，體質量200～350 g，雌雄各半。

1.2 主要試劑

兔抗Nestin多克隆抗體(BA1289)(博士德生物公司)；PrimeScriptTM RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)；PCR引物由上海生物工程公司合成。

2 方法

2.1 動物分組

72只大鼠隨機分為假手術組、模型組和針刺組，每組各24只。

2.2 MCAO造模

參照馬英等相關研究[2]方法制作。先以10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，頸前正中縱行切口，長約2.0～2.5 cm，鈍性分離并結扎右側頸總動脈(CCA)，并穿一線備用。分離頸內動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)，結扎ECA，用微動脈夾夾閉ICA，在近CCA分叉處剪一“V”字型切口，將直徑為0.2～0.25 mm尼龍線頭端涂抹硅膠脂，沿CCA插入ICA，同時放開微動脈夾，輕輕牽拉使栓線進入顱腔，插入深度18～20 mm，稍遇阻力即停，造成MCA阻塞。將CCA上的備線扎緊。1 h后緩慢退出部分線栓進行再灌注。假手術組只做手術暴露頸部動脈，結扎CCA，但不予線栓。

2.3 針刺方法

按中國針灸學會實驗針灸委員會實驗動物穴位圖譜[3]，選取大鼠頭穴運動區，即“百會”穴透“太陽”穴，由頂骨正中向耳前方斜刺。用0.19 mm×10 mm毫針于術后大鼠清醒即開始行雙側針刺并接G6805-Ⅱ型電針治療儀(四川恒明科技開發有限公司)，斷續波，以大鼠安靜耐受微顫為度，每天針刺1次，留針30 min。模型組和假手術組略做捆綁，不作針刺處理。

2.4 橫木行走實驗

治療第3天、7天、14天后處死前分別進行。橫木是長80 cm、寬2.5 cm的方木，距離地面10 cm平放，使大鼠在橫木上行走[4]。

評分標準:0分:上即跌落；1分:可滯留但不能行走；2分:可行走，時有跌落；3分:可行走，但左側肢體不能主動向前移動；4分:行走時有多于50%行程的滑步；5分:行走時有少于50%行程的滑步；6分:行走時沒有滑步。

2.5 樣本采集

治療第3天、7天、14天后禁食過夜，各組動物分別隨機選取8只用10%水合氯醛腹腔麻醉后，斷頭取腦，迅速在冰盤上修取MCA供血區(右側缺血側)的海馬。

2.6 Western blot法檢測Nestin蛋白表達

取海馬組織加入裂解液，按說明書提取總蛋白，測定蛋白濃度。凝膠電泳分離蛋白質，電轉至PVDF膜，用含脫脂奶粉的TBS室溫封閉2 h，加入Nestin抗體(兔抗大鼠Nestin抗體，1∶200) 4℃孵育過夜。用含Tween-20的 TBS洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶2 000) 室溫孵育1 h，重復洗滌3次，ECL液顯色，X片顯影、定影。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析測定Western blot條帶灰度值，結果以Nestin與內參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)灰度值的比值作為目的蛋白的表達水平。

2.7 實時定量RT-PCR檢測NGF mRNA基因表達

采用Trizol一步法試劑盒提取神經組織細胞總RNA，鑒定總RNA純度、完整性，取總RNA逆轉錄為c DNA。用于反應的引物分別為：NGF，上游引物為5′-TCCACCCACCCAGTCTTCCA-3′，下游引物為5′-GCCTTCCTGCTGAGCACACA-3′；GAPDH，上游引物為5′-CCTTCCTGGGCATGGAGTCCTG-3′，下游引物為5′-GGAGCAATGATCTTGATCTTC-3。表達采用2-ΔΔCT方法計算，每個樣品獨立檢測3次，所得均值以GAPDH為內參統計。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠橫木行走實驗評分

表1顯示，假手術組在第3、7、14天橫木行走實驗評分均為6分，表明神經功能沒有出現缺損。與假手術組比較，模型組和針刺組評分均降低，差異有統計學意義(P<0.01)，且在第14天，針刺組比模型組評分提高，差異有統計學意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠橫木行走實驗評分比較

3.2 各組大鼠海馬Nestin蛋白表達

圖1顯示，假手術組、模型組和針刺組均可見Nestin表達。

圖1 各組腦缺血大鼠Western blot法Nestin蛋白表達

圖2顯示，Nestin蛋白表達水平模型組與假手術組比較顯著降低(P<0.05);針刺組明顯高于模型組(P<0.01),且14 d達最高水平。

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01。圖2 各組大鼠海馬Western blot法定量檢測Nestin蛋白表達

3.3 各組大鼠海馬NGF mRNA表達

圖3顯示，假手術組NGF mRNA表達在術后并無明顯區別，模型組自第7天提升量最為明顯，接近假手術組的水平，14 d表達下降。針刺組與模型組比較3 d、7 d、14 d都有顯著差異(P<0.01)。

注：與模型組比較，**P<0.01。圖3 各組大鼠海馬NGF mRNA的表達水平

4 討論

缺血性腦中風屬中醫“風”“癆”“鼓”“膈”四大難證之一[5]。迄今為止，腦中風造成的神經細胞損傷和死亡尚無確定的治療方法。因此，如何積極有效地促進腦缺血后受損腦組織的修復與神經功能恢復是目前研究的重點、難點和熱點，也始終是人們追求的理想的治療境界。近現代中醫認為中風的主要原因是肝陽化風、氣血并逆、直沖犯腦[6-7]。“病變在腦，首取督脈”，督脈有溝通陰陽、總攝諸經之能力，為治療缺血性腦中風的首選。百會穴為督脈要穴。選取運動區即百會穴透太陽穴，在此處行焦氏頭針[8]有醒神開竅、安神定志、平肝熄風的作用。運動區貫穿頭部頂、額、顳3區，形成百會-承靈-懸厘-太陽穴的一穴區貫穿多穴的特點，且跨越3條陽經(督脈、足太陽膀胱經、足少陽膽經)，從頭至足，縱貫全身，實可統調一身之陽氣。電針刺激后將產生的生物效應傳送至大腦皮層，使穴位刺激點與病灶興奮點間相互聯系、相互作用，激活、加強休眠狀態下的腦細胞和受損腦神經細胞的修復能力，促進腦組織的可塑性調節，調節血管舒縮功能，改善神經功能障礙，增進功能恢復[9]。

肢端精細運動和協調功能損害是腦缺血損傷后的主要癥狀。利用橫木行走實驗可較好地檢測神經功能障礙。本實驗結果顯示，模型組和針刺組的評分均顯著低于假手術組(P<0.01)。模型組自第3天開始評分升高，第7天最高，第14天下降，提示MCAO大鼠神經功能在一定時間段可有部分代償性自我修復能力，但這種能力持續短暫。與模型組比較，針刺組隨著治療時間的延長橫木實驗評分呈現明顯升高趨勢，針刺14 d差異具有差計學意義(P<0.01)，表明針刺運動區能明顯改善腦缺血損傷后大鼠神經功能缺損的癥狀，進而降低缺血缺氧對組織的損傷，促進受損區的修復和功能重建，且治療效果隨著針刺時程的延長而提高。

巢蛋白(Nestin)亦稱神經上皮干細胞蛋白，是一種Ⅵ型中間絲蛋白，在神經前體細胞一過性表達，當神經前體細胞轉化為神經元之后由其他的中間絲蛋白所取代，故與神經細胞分化密切相關[10-11]，常作為NSCs(神經干細胞)特異性的標記物。Nestin為 NSCs的自我更新所需[12]。本實驗結果表明假手術組、模型組和針刺組海馬組織內均可見Nestin表達。腦缺血損傷發生初期，模型組中Nestin蛋白表達水平較假手術組顯著降低(P<0.05)，這主要是因為大腦中動脈供血區組織破壞嚴重，難以恢復對損傷的有效修復，不能進一步激活機體的自我保護機制。已有研究表明，機體成年后，室管膜細胞基本處于“靜止”狀態，而一旦遭受損傷，則可應激進入活躍的分化狀態。但這種內源性神經細胞的再生并不能很好修復缺血區損傷，加之誘導NSCs遷移與分化的微環境條件不具備，因此需要采取有效的干預措施來增強NSCs的增殖與分化并促進神經功能的恢復[13]。本實驗經電針刺激運動區后，針刺組中Nestin蛋白表達水平明顯高于模型組(P<0.01),且14 d組為表達最高。這表明電針運動區可激活內源性NSCs，使其增殖和分化，幫助神經元的再生和細胞骨架的重構，促進神經組織的重建和神經功能的恢復。

NGF對調節神經細胞的生發、分化、維持成熟神經細胞生存以及對損傷神經的修復具有重要意義及臨床價值[14-15]。本實驗假手術組NGF mRNA表達無明顯差異。模型組自第3天開始表達升高，第7天達到高峰，接近假手術組水平，到第14天表達下降。提示腦缺血損傷后可應激性上調NGF表達水平，改善神經組織的病理狀態，保護和修復受損神經元，減輕神經損害。但此內源性修復機制上調NGF作用短暫、表達有限，難以對損傷神經元產生全面持久保護，效應有限。針刺組不同時間點NGF mRNA的表達均高于模型組(P<0.01)，說明電針運動區可有效提高MCAO大鼠海馬內NGF mRNA持續性表達，穩定神經細胞存活的內部微環境和營造適合神經細胞生長的外部微環境，對受損神經細胞發揮保護作用，并對遭受可逆性損傷的神經細胞和膠質細胞進行修復，減緩腦缺血后神經細胞的死亡從而改善相伴的神經功能缺損癥狀[16]。

綜上所述，腦缺血損傷后腦NGF mRNA代償性增加的自我保護機制促進了神經元和神經細胞的修復，這種自我保護非常有限，而電針刺激運動區的介入可以有效促進NGF mRNA持續性表達，改善神經細胞存活的內、外部微環境，同時激活了處于“靜止”狀態的內源性NSCs，使其增殖和分化，促進神經組織的重建和神經功能的恢復。