重組腺病毒p53 基因對口腔鱗癌患者外周淋巴細胞亞群的影響

劉三霞 王 超 鄧子輝 王 剛 王 昊 胡 敏

多種腫瘤的體外移植瘤模型和臨床研究均表明Ad-p53 的局部應用能有效抑制腫瘤的進展、阻止新生腫瘤的形成[1-6]。我們在既往研究中也評價了手術聯合Ad-p53 局部注射治療口腔鱗癌患者的安全性和有效性[7]。但機體對Ad-p53 局部應用產生的免疫反應還不是很清楚，而機體的抗腫瘤免疫反應對于腫瘤患者來說尤其重要，因此我們需要觀察局部應用Ad-p53 后機體免疫功能的變化。

淋巴細胞亞群在細胞抗腫瘤免疫反應中起重要作用。外周血中淋巴細胞亞群比例的分布反映了機體抗腫瘤免疫狀態。利用流式細胞儀分析外周血中淋巴細胞亞群在醫學上應用廣泛，其有助于多種疾病的診斷和治療，如自身免疫性疾病、免疫缺陷、感染、惡性腫瘤和器官移植等[8]。因此我們對在我院接受手術和重組人腺病毒p53 注射液(rAdp53)聯合治療的12 位口腔癌患者治療前后的外周血淋巴細胞亞群進行檢測，并與正常人群、以及僅接受手術治療的12 例口腔癌患者進行對比分析，以評估局部注射rAd-p53 對口腔癌患者抗腫瘤免疫功能的影響。

1.資料與方法

1.1 臨床資料 共有36 例符合入選標準的口腔癌患者納入臨床研究，均為我院2012 年8 月至2015 年1 月住院并行手術治療的口腔癌患者。病例入選標準如下[7]：外周血象、肝、腎功能和凝血功能基本正常；病理檢查證實為口腔鱗狀細胞癌；病灶手術可切除，年齡大于18 周歲。排除標準：有腫瘤遠處轉移；既往放療或化療史；近期內使用抗病毒藥物者，長期服用免疫抑制藥物或因其他原因引起的免疫功能缺陷者。

經充分告知后，患者自主選擇是否行rAdp53局部注射治療，并簽署知情同意書。根據患者是否自愿接受rAdp53 治療分為用藥組(rAdp53 聯合手術治療組)和對照組(單純手術治療組)。用藥組募集15 位患者，對照組21 例，但實驗組和對照組均只有12 名患者完成治療前及治療后淋巴細胞亞群檢測。兩組患者基本信息、發病部位、臨床分期及腫瘤分化程度等詳細資料見表1，經非配對t 檢驗或卡平方檢驗，用藥組和對照組在年齡、性別、臨床分期和腫瘤分化方面均無統計學差異。

表1 口腔癌患者臨床資料情況表

1.2 主要試劑及儀器 主要試劑有CD8-FITC/CD4-PE/ CD3-PC5 標記三色熒光素抗體及其同型陰性對照，CD3-FITC/ CD56-PE/ CD16-PC5標記三色熒光素抗體及其同型陰性對照，CD8-FITC、CD28-FITC、CD45RO-FITC、CD29-FITC、CD45RAPE、CD25-PE、HLA-DR-PE、CD19-ECD、CD8-ECD、CD3-PC5、CD4-PC7 標記單色熒光素抗體及FITC、PE、ECD、PC5、PC7 單色同型陰性對照抗體；Q-prep 自動溶血儀、流式細胞儀(Cytometer FC 500 MPL)均為美國Beckman Coulter 公司所產。

1.3 方法 用藥組患者術中腫瘤擴大切除后于手術切緣多點注射重組人腺病毒p53 注射液1×1012VP/ 2cm2(用生理鹽水稀釋后使用)，術后隔天給予rAd-p53 1×1012VP，共3 次。對照組患者僅行手術治療。所有患者手術前1 天、手術后1 周均抽取2ml 外周血利用流式細胞儀進行淋巴細胞亞群表型分析檢測。此外，為了驗證口腔癌患者確實存在免疫功能紊亂，尤其是淋巴細胞亞群比例失衡，我們與解放軍總醫院腫瘤研究所流式檢測中心合作，募集了77 位健康志愿者，對其外周淋巴細T cell)和輔助性T 細胞(CD3+CD4+T cell)比參考值明顯降低(圖1A，unparied t test，P＜0.05)。然而，細胞毒性/ 抑制性T 細胞(CD3+CD8+T cell)和CD4+T/ CD8+T 比值僅輕度降低(圖1A，unparied t test，P＞0.05)。NK 細胞(CD3-CD16+CD56+)比例增加而NK 樣T 細胞(CD3+CD16+CD56+)降低，兩者的變化均無統計學意義(圖12B，unparied t test，P＞0.05)。胞亞群進行流式分析。這些志愿者被要求大于18周歲，性別不限，身體健康，無全身系統性疾病，無長期服藥史及近期服藥史。

表2 所有口腔癌患者及健康志愿者外周淋巴細胞亞群比例(M±SEM)

1.4 統計學處理 采用SPSS13.0 軟件統計分析，利用非配對t 檢驗(the mean±standard error，M±SEM)對治療前口腔癌患者與健康志愿者之間以及治療前兩組間各細胞亞群比例進行組間差異性分析；采用自身配對t 檢驗比較兩組患者治療前后各細胞亞群比例變化規律及有無顯著性差異，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 口腔癌患者外周淋巴細胞免疫功能狀態納入研究的36 位口腔癌患者治療前均行外周血淋巴細胞亞群檢測，口腔癌患者的NK 細胞和T 淋巴細胞亞群比例以及從健康志愿者中統計得到的參考值均在表2 中列出(M±SEM)。并以柱狀圖的形式對口腔癌患者與健康志愿者的各淋巴細胞亞群進行了比較，如圖1。在此研究中，總T 細胞(CD3+

圖1 口腔癌患者與健康志愿者的各淋巴細胞亞群比例柱狀比較圖

根據淋巴細胞表面活化分子HLA-DR 和CD28分子的表達，檢測了外周血中活化淋巴細胞的比例。在口腔癌患者中，活化總T 細胞(CD3+HLADR+)較參考值明顯增高，同時靜止總T 細胞(CD3+HLA-DR-)比例較參考值明顯降低，兩者與參考值的差異均有統計學意義(圖1C，unparied t test，P＜0.01)。共刺激分子CD28 的表達比例以及細胞毒 性T 細 胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs，CD8+CD28+)比例較參考值明顯降低(unparied t test，P＜0.0001)，而抑制性T 細胞(suppressor T lymphocytes，Ts，CD8+CD28-)則出現輕度增加(圖1D，unparied t test，P＞0.05)。

2.2 rAdp53 誘導的外周細胞免疫反應 為了觀察或評價rAdp53 對患者外周淋巴細胞的影響，我們比較了用藥組和對照組之間各淋巴細胞亞群的比例。檢測值以M±SEM 的形式在表2 中列出，統計學分析得到的P 值見表3。圖2 為實驗組和對照組患者淋巴細胞亞群比例分布的散點圖。檢測結果如下：治療前實驗組和對照組各淋巴細胞亞群比例均無明顯差異(unpaired t test，P＞0.05)。治療后對照組總T 細胞(CD3+T) 和CD8+T 比例均降低，而CD4+輔助性T 細胞比例和CD4/ CD8 比值增加；用藥組患者治療后總T 細胞比例變化與對照組相同，均較治療前降低，而CD4+輔助性T 細胞和CD4/ CD8 比值下降，CD8+T 細胞無變化。NK 細胞在用藥組中比例輕度增高而在對照組中輕度降低；NKT 細胞變化趨勢同NK 細胞。經統計學分析，這些變化均無顯著性差異(圖2A，B，paried t test，P＞0.05)。

實驗組患者治療后活化總T 細胞和細胞毒性T 細胞較治療前均增加，而靜止性總T 細胞和抑制性T 細胞較治療前降低。相反，對照組的活化總T 細胞和細胞毒性T 細胞治療后比例均低于治療前(圖2C，D)，同時抑制性T 細胞比例也較治療前增加。盡管這些變化中，僅實驗組靜止性T 細胞比例降低與治療前相比具有顯著性差異(Ts，P＜0.05)，但其他細胞亞群的增加-降低趨勢是很明顯的。

3.討論

腫瘤細胞和免疫系統之間的相互作用非常復雜，在惡性腫瘤患者中往往存在機體免疫平衡失調，尤其是在機體抗腫瘤免疫反應中起重要調控作用的T 淋巴細胞亞群出現平衡失調。癌癥患者包括頭頸癌已被公認為存在免疫功能紊亂[9-10]，也有證據表明口腔癌患者外周血淋巴細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞存在著免疫缺陷[11]。外周細胞免疫功能缺陷影響頭頸癌患者預后，如外周血中CD8+T 細胞[12]、NKT 細胞[13]比例降低被認為與預后差相關。NK細胞比例降低被認為可能導致了頭頸癌患者免疫逃逸的結果[14]。因此在頭頸癌患者外周血中檢測機體自身腫瘤特異性T 細胞反應和抗腫瘤治療或者免疫治療誘導的腫瘤特異性反應是必要的。在我們的研究中，口腔癌患者總T 細胞和CD4+T 細胞比例較健康人群明顯降低，共刺激信號分子CD28 的表達比例、細胞毒性T 細胞比例明顯降低而抑制性T 細胞比例增高。此外，活化總T 細胞明顯增加而靜止總T 細胞明顯降低。這些淋巴細胞亞群比例的變化(與健康人群比較)具有顯著性差異，這種淋巴細胞亞群比例分布異常表明口腔癌患者確實存在免疫功能缺陷。

表3 不同組間外周淋巴細胞亞群T 檢驗P 值表

圖2 用藥組和非用藥組患者淋巴細胞亞群比例分布的散點圖

手術治療或聯合放化療是口腔癌治療的主要方法。放化療對骨髓具有明顯抑制作用，而之前的研究發現癌癥患者手術后淋巴細胞的免疫功能可不同程度的恢復[15-16]。這可能與瘤體去除后，腫瘤產生的免疫抑制因子減少或消失有關；或者手術能誘導創傷應激反應從而增強抗腫瘤免疫功能。然而，也有一些研究表明由于殘留的微小病灶存在、手術創傷的刺激以及放化療的副作用，使癌癥患者的免疫抑制狀態在治療后會持續很長時間[15]。Bottcher[17]等發現外周血中T 細胞和NK 細胞的比例分布與患者接受到的治療方式相關，尤其易受手術聯合放化療治療方法的影響。在本研究中，對照組患者手術前后各淋巴細胞亞群比例無明顯變化，表明對照組患者在接受手術治療后免疫抑制狀態仍然存在。因此，在進行手術或放化療的同時，適時采取相應的輔助措施，增強腫瘤患者的免疫功能，可能能更好的抑制腫瘤的復發和轉移。

大量的研究表明重組腺病毒攜帶的wtp53 基因抗腫瘤療效主要與wtp53 基因抑制細胞周期、誘導細胞凋亡作用相關。但也有些研究認為p53 與免疫系統之間的密切關系在有效抑制甚至消滅腫瘤細胞的過程中起重要作用[18]。比如，p53 蛋白能作為腫瘤相關抗原刺激免疫反應。此外，p53 還能作為轉錄因子，直接激活免疫細胞某些基因的表達，在這些細胞的增殖和功能方面發揮重要的調節作用。野生型p53 功能的缺乏通過干擾炎性調節因子的表達來影響固有免疫反應[19]。外源性wtp53 轉導進入腫瘤細胞后能作為腫瘤特異性抗原激活NK細胞[20]和T 細胞[21]。通過復制缺陷型腺病毒轉染進入腫瘤細胞的wtp53 在腫瘤細胞內過表達，導致p53 蛋白在細胞質內積聚。一部分壞死的腫瘤細胞釋放的P53 蛋白被抗原提呈細胞加工提呈給T 細胞。P53 特異性T 細胞被活化并誘導抗腫瘤免疫反應[18]。還有些文獻報道野生型和突變型p53 蛋白特異性多肽能在正常鼠或荷瘤鼠體內誘導MHC-II限制性CD4+T 細胞活化[22-23]。在我們的研究中，用藥組患者HLA-DR 分子的表達和活化總T 細胞的比例在治療后較治療前明顯增加而靜止總T細胞明顯降低。相反，對照組患者治療前后無明顯變化。

有文獻報道，當注射Ad-p53 后，腫瘤細胞內過量表達外源性野生型p53 蛋白，能被細胞內NKG2D 分子提呈到細胞表面，作為腫瘤抗原，刺激機體產生腫瘤特異性的CTL 細胞[24]。這與本研究中用藥組患者治療后細胞毒性T 細胞比例較治療前上調，而抑制性T 細胞比例降低相符合。變化幅度雖未達到統計學意義，但這種增加-降低的趨勢很明顯。變化無顯著性差異可能與納入研究的口腔癌患者數目少有關。Hoffmann[25]與Tsukishiro 等[26]發現頭頸癌患者外周循環中CD8+T 細胞尤其是細胞毒性T 細胞對凋亡非常敏感，甚至是凋亡的首選靶細胞。這可能是用藥組細胞毒性T 細胞的增加幅度未達到統計學差異的另一重要原因。

NK 細胞主要在外周血中循環。然而，在某些病理條件下如病毒或細菌感染，NK 細胞能選擇性的聚集在感染的組織部位[27]。腺病毒載體是目前用于基因轉染最有效的載體之一，它具有免疫原性，能誘導炎性反應，這種炎性反應曾被認為是腺病毒作為載體的副作用。然而，腺病毒載體誘導的炎性反應能激活抗腫瘤免疫效應細胞如巨噬細胞和NK細胞，從而在短時間內增強抗腫瘤反應。而且，一些研究表明NK 細胞能表達一些趨化因子受體，對一些趨化因子產生反應[28]。p53 可以轉錄上調Ⅳ型跨膜趨化因子Fractalkine 的表達，表達Fractalkine 的癌細胞可與表達Fractalkine 受體的NK 細胞緊密結合，從而被NK 細胞殺滅。一項關于Ad-p53 治療卵巢癌的研究表明NK 細胞在Ad-p53 產生的旁觀效應中起重要作用[20]。在本研究中，用藥組NK 細胞比例輕度增加，而對照組輕度降低。NK 細胞比例在兩組中的不同變化趨勢可能與是否接受rAdp53 治療有關。我們推測本研究中有限的患者數目是導致NK 細胞比例在兩組中的變化均未達到統計學差異的原因。

綜上所述，我們在此研究中檢測并分析了口腔癌患者的細胞免疫功能狀態以及比較了接受rAdp53治療患者淋巴細胞亞群比例的變化，我們發現口腔癌患者確實存在抗腫瘤免疫功能缺陷，手術在短時間內并不能有效改善患者的抗腫瘤免疫功能。而作為輔助治療手段，在圍手術期局部應用rAd-p53能在一定程度上增強患者的抗腫瘤免疫能力。由于本研究中患者的隨訪期還較短，rAd-p53 對口腔癌患者產生的外周淋巴細胞亞群的變化能維持多長時間及其與患者預后的關系尚不能進行分析，但從用藥后免疫功能改善這方面推測，口腔癌患者可能從手術聯合rAd-p53 局部應用治療中獲益。