依普黃酮對骨質疏松成骨細胞增殖分化能力影響的研究

于書娟 劉洪臣

骨質疏松癥的預防和治療不僅是一個現代醫學面臨的問題，也是一個社會問題。在1993 年，骨質疏松癥被定義為一種系統性的骨疾病，并且以骨量丟失，骨微結構退化，骨脆性和骨折增加為特點。由于全身骨量丟失和頜骨骨量丟失的相關性[1]，許多用于系統性骨質疏松癥的藥物用于研究對頜骨骨量的影響[2，3]。其中依普黃酮作為一種廣受關注的藥物，其在臨床上的應用前景很大[4，5]。我們之前的實驗研究已經發現來源于骨質疏松大鼠頜骨的成骨細胞在增殖和分化上均有改變[6]，并且低濃度的雌二醇對骨質疏松大鼠頜骨成骨細胞的生物學活性有影響[7]。所以本研究主要關注依普黃酮對骨質疏松大鼠頜骨成骨細胞增殖和分化的影響，從而更進一步探索依普黃酮在口腔醫學上的應用，為頜骨骨質疏松的防治提供一定的研究基礎。

1.材料和方法

1.1 動物模型 所有的動物實驗均經過動物實驗倫理委員會同意。20 只約三個月大的Sprague-Dawley (SD)大鼠(300g，軍事醫科院動物實驗中心，北京，中國)，隨機分成兩個相同數量的組，一組作為假手術組，卵巢附近的一小塊脂肪組織被摘除；另一組作為去勢組，行雙側卵巢摘除術。

1.2 成骨細胞分離和培養 手術后12 周[8]，去勢組和假手術組通過血清中雌二醇水平和頜骨骨密度等進行比較，成功建立骨質疏松動物模型后，全麻下處死去勢組大鼠，無菌條件下取下頜骨，在文獻基礎上分離培養成骨細胞[6]。當培養的成骨細胞在培養板中融合到80%以上時，無血清培養基使成骨細胞同步化。將依普黃酮稀釋，得到實驗所需的濃度0M、10-9M、10-8M、10-7M 和10-6M。含不同濃度依普黃酮的培養基繼續培養成骨細胞72h。然后進行四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)法、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和骨鈣素(osteocalcin，OC)測定。

1.3 MTT 法 將成骨細胞接種在96 孔板中(1×104個細胞/ ml；200μl/ 孔)24 小時后，換成無血清培養基繼續培養24 小時，使細胞同步化。然后用含不同濃度依普黃酮的培養基(0M、10-9M、10-8M、10-7M 和10-6M)分別培養72 小時。接著在每孔中加入20μl 的MTT 溶液，在37℃下持續孵育4 小時。抽吸MTT 培養基后，用二甲基亞砜取代。在酶聯免疫吸附檢測器(ELx800 紫外型，Bio-Tek，美國)上以490 nm 的波長讀取數值。

1.4 堿性磷酸酶活性測定 將成骨細胞接種于12 孔板(1×105細胞/ ml；1ml/ 孔)中，在5%CO2和37℃下生長。第二天，用無血清培養基將細胞同步化培養24 小時，然后分別加入所配制濃度依普黃酮的培養基繼續培養72 小時。用PBS 清洗成骨細胞后，加入0.1%Triton X-100(300μl)在4℃下過夜裂解。將50μl 裂解物轉移到另一96 孔板中，并添加50μl 的4.5mmol/ l 對硝基苯磷酸鹽。然后將該96 孔板在37℃下再孵育30 分鐘。向每個孔中添加50μl 的0.1M 氫氧化鈉終止反應。在405nm 波長下測量產物的光密度。采用蛋白質分析(BCA 蛋白分析試劑盒，博斯特，中國)使蛋白質一致化。

1.5 骨鈣素測定 將骨質疏松頜骨的成骨細胞接種于12 孔板(1×105細胞/ ml；1ml/ 孔)，并且用無血清培養基將細胞同步化培養24 小時后，分別加入所配制濃度的依普黃酮培養基繼續培養72小時。收集細胞培養基，并使用自動電化學發光免疫分析法(瑞士羅氏Cobas E601)檢測培養基中的骨鈣素含量。

1.6 統計分析 結果用平均值±標準差表示。通過方差分析(ANOVA)進行統計分析，在達到統計顯著性時進行適當的子檢驗。P 值等于或小于0.05 被認為是顯著性的差別。

2.結果

2.1 成骨細胞生長觀察結果 骨質疏松大鼠頜骨成骨細胞(見圖1)，在無藥組中培養第5～7 天時，細胞鋪滿培養瓶。在依普黃酮干預組中，成骨細胞鋪滿培養瓶的速度明顯提高，比對照組快約1～2 天。

圖1 骨質疏松大鼠頜骨成骨細胞(×100)

2.2 MTT 檢測結果 依普黃酮干預培養骨質疏松頜骨成骨細胞后發現，含有依普黃酮組(10-9M、10-8M、10-7M 和10-6M)MTT 值均明顯高于不含依普黃酮組(圖2)，且差異具有統計學意義(P＜0.05)。其中不同濃度之間也有明顯差異(P＜0.05)，10-8M濃度的MTT 檢測值最高，其次是10-9M、然后是10-6M 和10-7M。

圖2 依普黃酮對骨質疏松大鼠頜骨成骨細胞MTT 值檢測的影響(*，P＜0.05)

2.3 堿性磷酸酶檢測結果 通過檢測成骨細胞堿性磷酸酶含量，并且蛋白質量一致后，結果(圖3)顯示含依普黃酮組堿性磷酸酶含量明顯高于不含依普黃酮組，P＜0.01。各濃度之間有明顯差異，表現規律與MTT 檢測值規律和細胞的觀察生長速度規律基本一致，并且，10-8M 組最高，P＜0.01。

圖3 依普黃酮對骨質疏松大鼠頜骨成骨細胞ALP 活性的影響(*，P＜0.01)

2.4 骨鈣素分泌量 見圖4。與不含依普黃酮組相比，依普黃酮組成骨細胞培養上清液中骨鈣素分泌量明顯增多，P＜0.01。各濃度之間也有明顯差異(P＜0.01)，其表現規律與MTT 檢測、ALP檢測和細胞的觀察生長速度規律略有不同，10-8M濃度的MTT 檢測值最高，其次是10-7M、然后是10-6M，四種濃度中最低的是10-9M。

圖4 依普黃酮對骨質疏松大鼠頜骨成骨細胞骨鈣素水平檢測的影響(*，P＜0.01)

3.討論

近年來，人們越來越關注系統性骨質疏松癥對口腔頜骨的影響，有研究報道，發現骨質疏松癥對種植體近中和遠中的邊緣骨丟失有顯著影響[9]；并且骨質疏松癥患者與牙周炎的臨床附著喪失和牙槽骨骨丟失相關，骨質疏松癥是牙周炎的一個高危因素，建議臨床上牙周炎和骨質疏松癥同時考慮[10]。同時建議種植體植入時要充分權衡使用治療骨質疏松癥的藥物(如雙磷酸鹽類)對頜骨的影響[11]。依普黃酮作為一種有效的防治骨質疏松的藥物，因為其較小的副作用在我國得到了廣泛的應用。依普黃酮可以通過阻斷Ihh 信號通路從而減輕軟骨退變[12]。并且，還通過促進成骨細胞增殖和減少破骨細胞數量從而促進新骨生成和抑制骨吸收[13]；通過促進骨髓間充質干細胞成骨，改善骨質量并保護骨組織[14]。但是，由于頜骨含有牙齒有其獨特性，對于依普黃酮對頜骨影響的研究很是必要。已經有研究報道依普黃酮可以增加頜骨骨小梁和骨皮質的骨密度，提示了依普黃酮對頜骨結構的影響[15]。我們通過對骨質疏松大鼠頜骨成骨細胞的培養，為依普黃酮對頜骨影響的研究提供了一種更好的方式，也為口腔醫學的進一步研究提供了細胞基礎。

前期本研究組已經對骨質疏松動物模型的成功建立和去勢組與假手術組之間的成骨細胞的區別進行過報道[6]。本次實驗主要是研究依普黃酮對骨質疏松成骨細胞的影響。并且之前我們研究表明低濃度雌二醇對骨質疏松大鼠下頜骨成骨細胞有明顯的促進增殖和分化的作用[7]。而依普黃酮對骨質疏松成骨細胞的影響，在本實驗中，通過MTT 法、ALP 法和OC 法檢測結果也表明，依普黃酮能促進成骨細胞的增殖，促進堿性磷酸酶和骨鈣素分化，從而使成骨細胞發揮更大的作用，在整個成骨細胞和破骨細胞的骨平衡中占據更主要的地位，使得成骨大于破骨，對骨質疏松頜骨起到防治作用，相應地對骨質疏松癥患者的種植手術的成功和長期效果也會起到一定的作用。同時，該研究還表明不同濃度的依普黃酮對骨質疏松大鼠頜骨成骨細胞的增殖和分化能力影響不同，細胞的觀察生長速度規律與MTT 檢測值規律以及ALP 值規律基本一致，提示了該實驗中不同濃度的依普黃酮對細胞增殖分化能力的影響有一定的規律，隨著依普黃酮濃度的增加，對成骨細胞增殖分化的促進作用逐漸增強，然后隨著藥物濃度的增加，這種促進作用減弱，其中10-8M 對細胞的作用最大，從而為依普黃酮口腔醫學上應用提供了一定的實驗基礎。對于依普黃酮對骨質疏松成骨細胞作用先增加后減弱的原因，可能是很多藥物都有自身合適的治療劑量，超過這個治療劑量后，藥物的作用可能出現質的變化，對機體產生不同程度的毒性或不良反應，對于骨質疏松成骨細胞來說，在本研究的研究藥物劑量中，10-8M 是起到最大作用效果的一個安全藥物濃度。但是有學者通過對M3T3 成骨細胞系的研究發現依普黃酮在10-10M 濃度時起到最大的促增殖分化的作用[16]。有差別的原因主要是因為所采用的細胞不同，也從側面提示了對骨質疏松頜骨成骨細胞培養和研究的必要性。

當然，對于骨質疏松癥在口腔醫學領域的研究仍然需要更加深入，從而為口腔醫學疾病的防治起到一定的作用。