川西高原昆蟲病原真菌的多樣性*

裴曉亞 Maduka Nilakshi Jayasekara Arachchige 朱晨慧 王 敦

(西北農林科技大學昆蟲學研究所 楊凌 712100)

川西高原是四川省西部與青海、西藏交界的高海拔區，地勢跌宕起伏,氣候復雜多變,地域差異顯著，孕育著豐富的生物種類，其中昆蟲和真菌資源十分豐富。全球昆蟲病原真菌種類豐富，迄今已記錄800多種蟲生真菌，我國已發現400余種(蒲蟄龍等，1996)。昆蟲病原真菌是重要的生物防治資源，同時也可以穩定生態系統中昆蟲種群。利用昆蟲病原真菌防治害蟲，對人、動物無毒害作用，對環境友好，因此在植物保護研究中受到廣泛關注(王濱等， 2005； 劉春來， 2017； 李增智， 2015)。目前，物種多樣性海拔分布格局及其形成機制是多樣性研究的一個重要課題(徐翔等，2018)，蟲生真菌的分布格局與海拔區域也有密切關系(李亦菲等， 2018)。

本文利用Hiseq技術對川西高原13個海拔樣地的土壤樣品進行測序，探討川西高原的昆蟲病原真菌種類資源、分布以及蟲生真菌多樣性沿海拔梯度的變化規律，分析海拔變化對昆蟲病原真菌多樣性的影響，為昆蟲病原真菌的開發利用以及川西高原物種多樣性的研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

按照“S”形取樣法，在雅安(多營鎮、天全縣、二郎山)、甘孜(雅江、新龍、滬定)和康定(折多山、新都橋)8個地域內共13個不同海拔區域進行隨機取樣。為避免土壤空間分布不均所導致的誤差，在每個海拔分別選取5個取樣點，每2個樣點之間間隔大于50 km。土壤樣品采集后立即封口，-10 ℃凍存于車載冰箱中，并用GPS記錄坐標、貼標簽。實驗室內將每個海拔的5個樣品混合，倒在滅菌后的紙上，用鑷子去除樣品中的植物根系、昆蟲、石塊等雜物，放于無菌臺內風干、研磨，過1～2 mm篩后隨機分為3份，保存于-80 ℃冰箱中，作為土壤微生物 DNA 提取的3個生物學重復。各土壤樣品信息如表1所示。

表1 土壤樣品信息

1.2 試驗方法

土壤總DNA的提取參考并改進Bürgmann等(2001)的方法，經過物理研磨、化學試劑萃取獲得總DNA。土壤總DNA的純化參考購自BioFlux公司DNA純化試劑盒(Gel DNA Purification Kit)的操作說明進行。

分別用13個土壤樣品的DNA為模板，擴增引物參考White(1990)方法，分別為ITS1(5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’),ITS4(5’TCCTCC GCTTATTGATATGC3’)，擴增體系為25 μL(10×Buffer 2.5 μL、d NTP 2 μL、上下引物各1 μL、模板0.3 μL、dd H2O 18.7 μL)，產物進行凝膠電泳處理、膠回收試劑盒對DNA進行回收，使用illumina Hiseq進行測序。

1.3 數據處理與分析

測序得到的原始數據，經過拼接、過濾、去除嵌合體成為有效數據，對其進行后續生物信息分析： 采用OTU(operational taxonomic units)即操作分類單元[為了便于進行分析，給某一個操作分類單元(品系、種、屬、分組等)設置同一標志，即97%的相似度進行OTU聚類], 結合微生物目前最權威的數據庫——Unite數據庫進行物種注釋和物種分類分析。 基于OTU的分析，獲得樣品的豐度信息，挖掘樣品之間的群落結構和物種組成差異。

采用香儂指數(Shannon)Hshannon、辛普森指數(Simpson)D、Chao1指數(OTU估計數SChao1及覆蓋率Coverage進行生物多樣性分析。計算公式如下：

Schao1=Sobs+n1(n1-1)/[2(n2+1)]，

coverage=[1-(ni/N)]×100%。

式中，Sobs為OTU實測數；ni為含有i條序列的OTU數目，N為全部序列數；Pi為ni/N。

2 結果與分析

2.1 測序數據預處理及OTU數統計

對13個海拔樣品的測序結果表明，平均每個樣品得到85 009條有效序列； 堿基質量值Q30比例均大于84.34%，滿足后期分析的要求。按照序列的相似性高于97%定義為一個OTU，共獲得51 515個OTU，其中13個樣品共有的OTU個數為50個，樣品DY、TQ、LD、ER、ZDS、Y1、Y2、Y3、XD、Y4、XL、Y5、Y6特有的OTU個數分別為228、1 179、863、682、1 346、1 466、1 556、316、1 540、724、790、1 880、1 127。

2.2 土壤中真菌的α多樣性分析

13個土壤樣品中真菌的α多樣性如表2所示。所有樣品的Coverage均超過94%，說明測序深度合理，可以反應樣本的真實情況，其中，香儂指數在5.14～9.27之間， 辛普森指數在0.77～0.99之間， Chao1指數在2 172～5 608之間。

表2 土壤中真菌多樣性指數統計結果

2.3 土壤中真菌等生物種類

對13個樣品51 515個OTU的分析表明，在門水平上，相對豐度排名前十位的分別為子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Bassidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)、纖毛門(Ciliophora)、壺菌門(Chytridiomycota)、綠藻門(Chlorophyta)、羅茲菌門(Rozellomycota)、絲足蟲類(Cercozoa)、球囊菌門(Glomeromycota)和芽枝霉門(Blastocladiomycota)(圖1)。其中，子囊菌門與擔子菌門在每個樣品中的共同占比超過69%，占絕對優勢。除樣品Dy之外，剩余12個樣本的優勢門均為子囊菌門，占比均超過49%，次優勢門為擔子菌門，占比均超過6%。在樣品Dy中，優勢菌門為擔子菌門，占比為62%，次優勢菌門為子囊菌門，占比13.7%。排名前十位的門，除羅茲菌門與芽枝霉門外，有8個門在13個樣品中均有分布。

圖1 土壤真菌在門水平的分布

從屬水平的分布來看(圖2)，13個樣品間的差異比較顯著，相對豐度排名前十位的分別是Echinoderma、絲膜菌屬(Cortinarius)、青霉屬(Penicillium)、被孢霉屬(Mortierella)、棒束孢屬(Isaria)、鐮刀菌屬(Fusarium)、假裸囊菌屬(Pseudogymnoascus)、赤霉菌屬(Gibberella)隱球菌屬(Cryptococcus)、小菇屬(Mycena)。13個樣本中最優勢屬均有差異，在樣品DY中，Echinoderma的占比為47.6%，占絕對優勢； 樣品Y3中的最優勢屬為絲膜菌屬，占比24%； 其他樣本中各最優勢屬均有差異。除Echinoderma、棒束孢屬與假裸囊菌屬之外，其他7個屬在13個樣本中均有分布。

圖2 土壤真菌在屬水平的分布

2.4 土壤中昆蟲病原真菌的種類

13個不同海拔樣本中的昆蟲病原真菌主要分布于子囊菌門肉座菌目(Hypocreales)的麥角菌科(Clavicipitaceae)、蟲草科(Cordycipitaceae)和線蟲草科(Ophiocordycipitaceae)。這3個科的OTU約占總OTU的2.08%，而每個科的占比在各個采樣點差距很大(圖3)。對于麥角菌科，樣品ZDS和DY的OTU占肉座菌目的6%，在13個樣品中最高； Y4在13個樣品中最低，只有0.08%； 13個樣品平均占肉座菌目OTU的3%。對于蟲草科，Y4的OTU在肉座菌目中的占比在13個樣品最高，為 78%； 在XD中只占0.5%； 平均占肉座菌目的21%。 對于線蟲草科，13個樣品的OTU在這個科中的占比是3個科中最低的，平均值只有1%，其中Y3占比最低，只有0.05%； Dy和Y6最高。

在13個樣品中檢測到的昆蟲病原真菌分屬于子囊菌門肉座菌目3個科中的18個屬。其中：麥角菌科7個屬，蟲草科6個屬，線蟲草科5個屬；綠僵菌屬(Metarhizium)、普可尼亞屬(Pochonia)以及彎頸霉屬(Tolypocladium)在全部樣品中都被檢測到； 棒束孢屬、蟲草屬(Cordyceps)以及線蟲草屬(Ophiocordyceps)在12個樣品中被檢測到； 淡紫紫霉屬(Purpureocillum)在9個樣本中被檢測到； 余下11個屬都分別只在1～4個樣本中被檢測到。如表3所示，13個樣品在屬水平上差異很大，Y1中屬的種類最多，共有11個，DY中屬的種類最少，只有4個，分別為綠僵菌屬、普可尼亞屬、Rotiferophthora、彎頸霉屬。

在麥角菌科中，綠僵菌屬在13個樣品中全都被檢測到，除樣品Y5之外，在余下樣本中的占比均超過60%，占絕對優勢； 在蟲草科中，除樣品DY之外，棒束孢屬和蟲草屬在余下的12個樣品中全部被檢測到，且共同占比均超過68%，占絕對優勢，但不同的樣本中，最優勢屬存在差異； 線蟲草科中彎頸霉屬在全部13個樣本中都被檢測到，在樣品DY、TQ、ER、ZDS、XD、Y5中都為優勢屬，淡紫紫霉屬在9個樣品中均為檢測出，且在樣品LD、Y1、Y4、Y5中均為優勢屬，在樣品Y3中，彎頸霉屬與線蟲草屬的占比均為50%，同為優勢屬。

圖3 不同樣品OTU數量占肉座菌目OTU數量百分比

表3 蟲生真菌各屬OTUs占同一樣品本科所有OTUs的比例

2.5 蟲生真菌多樣性沿海拔梯度的變化

13個樣品的采樣地點均在川西高原，DY、TQ、LD、ER、ZDS、Y1、Y2、Y3、XD、Y4、XL、Y5、Y6海拔依次升高(500～4 300 m)，跨度達3 800 m。通過OTU分析子囊菌門肉座菌目3個科中的優勢屬的OTU占比(圖4)發現：麥角菌科的普可尼亞屬隨海拔的升高沒有明顯變化，綠僵菌屬在500～1 000 m隨海拔升高而降低，在2 100 m處達到峰值，然后隨海拔的升高而下降； 在蟲草科中，棒束孢屬和蟲草屬隨海拔高度的變化存在差異，但是這種變化并不是呈梯度遞增或是遞減，在500～2 100 m的范圍內變化不大，基本在1%左右浮動，2 800 m之后數值開始大幅度變化，2 800～3 400 m依次遞增，2個屬分別在3 100 m與3 400 m處達到第1個頂峰，之后在3 471 m處達到一個低值，在3 700 m處又突然增高到達第2個頂峰，也是棒束孢屬的最高值，3 700 m后逐漸減少，而蟲草屬在4 300 m處達到第3個峰值，且為最高值。由此推斷，海拔會影響蟲生真菌的多樣性，特別是蟲草科，其優勢屬OTU在肉座菌目OTU的占比與海拔相關，在4 300 m采樣點蟲草屬占比最大，在3 700 m采樣點棒束孢屬的占比最大，而在2 100 m以下蟲草科真菌種類極少。海拔3 471 m處蟲草科的2個優勢屬均處于2個峰值(3 400、3 700 m)占比之間，其比值很低，可能與其他環境因子有關，也可能是測序樣本誤差導致，具體原因還需進一步研究。線蟲草科的優勢屬彎頸屬與淡紫紫霉屬隨海拔的變化其變化差異不大，基本在1%以下。

圖4 真菌優勢屬與海拔的相關性

3 討論

豐富的物種資源對維持生態系統平衡起著至關重要的作用，土壤功能的保持同樣需要多種微生物資源來平衡(雷霆等， 2007)。本文通過對川西高原的土壤樣品進行測序分析，發現昆蟲病原真菌共有18個屬，表明川西高原昆蟲病原真菌群落豐富，其昆蟲病原真菌類型數量高于安徽紫蓬山國家森林公園(劉玉軍等， 2018)，安徽瑯琊山、鷂落坪、麻姑山(陳名君， 2008)和山西龐泉溝自然保護區(李文英等， 2003a)等等。

昆蟲病原真菌存在明顯地域分布特點，其種類豐富程度與環境有很大的關系(李文英等， 2003b)，包括海拔、植被以及地理位置等都與昆蟲病原真菌的種類數量與組成結構存在顯著差異(陳名君， 2008)。本文的分析結果表明，13個樣本的昆蟲病原真菌種類及分布都存在差異，檢測到的蟲生真菌主要存在于肉座菌目的3個科中，其中各科的優勢屬的分布均有差異，棒束孢屬和蟲草屬作為蟲草科的優勢屬，在除樣本DY以外都有分布，且在海拔超過2 100 m時相對豐度升高，表明其適合在高海拔地區生長； 白僵菌作為1種重要的蟲生真菌，在此次取樣點中鮮有分布，而在其他地區昆蟲病原真菌的調查中常常為優勢屬種(周家喜等， 2017； 王四寶等， 2004)，但這些地區的海拔均低于2 000 m，而川西高原海拔遠遠高于2 000 m。綠僵菌屬的相對豐度雖在2 100 m處有峰值，但總體表現為隨海拔的升高而下降，與Masoudi等(2018)的研究結果一致； 蟲草科在2 100 m以上地區相對豐度較大，適合在高海拔地區生長，可能是因為氣候條件適合且高海拔地區人為因素的影響相對較小，具體原因有待進一步研究。

對川西高原的昆蟲病原真菌多樣性的研究有助于昆蟲病原真菌的開發與利用，也可為川西高原物種多樣性的研究提供基礎數據。

4 結論

本研究對川西高原的13個不同地點的土壤真菌樣品進行測序，分析其病原微生物的種類及分布。門水平上，子囊菌門與擔子菌門在每個樣品中的共同占比超過69%，占據絕對優勢。從屬水平分布來看，不同樣品的優勢屬存在差異，說明13個樣品的蟲生真菌種類存在差異。昆蟲病原真菌主要分布于子囊菌門肉座菌目的3個科。蟲草屬與棒束孢屬的相對豐度隨海拔的升高，分別在4 300與3 700 m達到峰值； 而綠僵菌屬隨海拔的升高其相對豐度降低，說明相對于蟲草菌科真菌，低海拔地區綠僵菌屬真菌豐富度較高。