亞熱帶主要造林樹種土壤氮保留及相關功能的微生物特征*

王 磊 梁藝凡 楊軍錢 張冰冰 王 濤 施秀珍 胡行偉 黃志群

(1.福建師范大學地理科學學院 福建師范大學濕潤亞熱帶山地生態國家重點實驗室培育基地 福州 350007)

全球許多地區氮沉降已超過植物和微生物的需求，出現氮飽和現象。我國亞熱帶地區是全球氮飽和最嚴重區域之一，引起國內外廣泛關注(Moetal., 2008)。氮素流失將會導致水體富營養化(Howarthetal., 1988)、地下水污染(Peterjohnetal., 1996)、土壤酸化(Vitouseketal., 1997)、生態系統養分失衡(Schulzeetal., 1989)和全球氣候變化(Huetal., 2015)等一系列問題。因此，如何減少我國亞熱帶森林土壤氮流失成為亟待解決的科學問題。

土壤氮循環過程(包括固氮、硝化和反硝化作用等)主要由相關功能微生物驅動。固氮作用是土壤固氮微生物將大氣中N2轉化成NH3的過程，對增加氮素輸入、提高土壤肥力有重要作用。編碼固氮酶nifH基因是研究固氮微生物最常用的標記物(Mirzaetal., 2014)，但是目前對森林土壤中nifH基因豐度的研究還很缺乏(Levy-Boothetal., 2014)。氨氧化作用是土壤硝化作用的限速步驟，主要由氨氧化古菌(ammonia oxidizing archaea, AOA)和氨氧化細菌(ammonia oxidizing bacteria, AOB)驅動(賀紀正等， 2009)。反硝化作用是反硝化微生物將NO3--N依次還原為N2O或N2的過程(賀紀正等， 2013)。土壤硝酸鹽淋溶及氮氧化物溫室氣體的排放是亞熱帶森林生態系統氮損失的主要途徑(Zhangetal., 2014)。充分認識樹種如何影響土壤固氮、硝化和反硝化微生物功能基因豐度及群落結構，對于提高土壤氮保留能力具有重要意義。

樹種通過作用于多個氮循環過程影響土壤氮保留，不同樹種土壤氮保留能力顯著差異(Templaretal., 2005)。Morales等(2010)研究發現森林土壤比農業土壤中nifH基因豐度更高。Levy-Booth等(2010)發現nifH基因豐度與花旗松(Pseudotsugamenziesii)土壤有機碳含量顯著正相關。森林土壤pH值、含水量、C/N、有機碳及黏粒含量是影響AOA和AOB生態位分化的重要非生物因子(Luetal., 2015;Shietal., 2016;Wessénetal., 2011)。李永春等(2014)發現由于杉木(Cunninghamialanceolata)根系分泌物及枯枝落葉分解導致土壤pH值降低，可能利于AOA生長。亞熱帶森林土壤的反硝化作用主要受氧化還原電位、土層深度、土壤有機碳含量等因素調控(Xuetal., 2007;Zhangetal., 2014)。Reverchon等(2015)發現柚木(Tectonagrandis)和白飯樹(Flueggeavirosa)混栽，能顯著增加編碼硝酸鹽還原酶narG、編碼亞硝酸鹽還原酶nirS和編碼一氧化二氮還原酶nosZ基因的豐度；大多數反硝化基因豐度與土壤全氮含量、土壤C/N顯著相關。

本文以亞熱帶5種人工純林，閩楠(Phoebebournei)、火力楠(Micheliamacclurei)、木荷(Schimasuperba)、杉木和福建柏(Fokieniahodginsii)為對象，探討主要造林樹種對土壤氮循環相關功能微生物基因豐度和群落結構的影響，闡明樹種對土壤氮保留影響的微生物驅動機制，為我國調整人工林樹種、提高人工林生產力和可持續性、減少氮流失等提供科學依據。

1 研究區概況

樣地位于福建廈門市汀溪國有防護林場(24°49′N，118°07′E)，屬南亞熱帶海洋性季風氣候，光熱充足、雨量豐沛、夏秋季節多臺風，年均溫20.6 ℃，年均降水量1 568 mm，降水主要發生在3—9月。主要地貌類型為低山丘陵，平均海拔202～390 m，土壤以酸性紅壤為主。選取立地基本一致的閩楠、火力楠、木荷、杉木和福建柏5種人工林(基本情況見表1)，其前茬樹種分別為杉木、馬尾松(Pinusmassoniana)、木荷、杉木和馬尾松。5種人工林的林下植被相似，主要有鐵線蕨(Adiantumcapillus-veneris)、烏毛蕨(Blechnumorientale)、藤黃檀(Dalbergiahancei)、寄生藤(Dendrotrophefrutescens)、酸葉膠藤(Ecdysantherarosea)、羊角藤(Morindaumbellata)、五節芒(Miscanthusfloridulus)、蒲公英(Taraxacummongolicum)、芒箕(GleichenialinearisClarke)、金毛狗(Cibotiumbarometz)等。

2 研究方法

2.1 樣地設置

2017年11月，在5種人工林中各設置3個20 m×20 m的樣地，共15個。同一樹種林分的3個重復之間距離1～3 km。

2.2 土壤樣品采集

2017年11月在各樣地內，采用內徑3.5 cm的土鉆沿樣地對角線上的10個點采集表層(0～10 cm)土樣，采集點距離樹干0.5 m以上，將同一樣地內的土樣混勻后裝入無菌自封袋，放入保鮮盒，盡快運回實驗室。在室內去除土樣中的砂石、可見根和動物等，過2 mm孔徑無菌篩網，充分混勻后分為3份： 1份儲存在4 ℃冰箱備用，用于測定土壤微生物生物量、礦質氮等； 1份放入2 mL的無菌離心管中，儲存在-80 ℃冰箱用于土壤微生物DNA提取和功能基因豐度測定； 1份在室溫下自然風干，用于測定土壤基本理化性質。

2.2 土壤理化性質及微生物生物量

采用玻璃電極pH計測定土壤pH值，土水比1∶2.5。烘干法測定土壤質量含水量。2 mol·L-1KCL溶液浸提新鮮土樣后，利用連續流動分析儀(Skalar San++,荷蘭)測定礦質氮含量。元素分析儀(Elemental EL MAX CNS analyzer,德國)測定土壤全碳和全氮含量并計算碳氮比。環刀法測定0～10 cm土層土壤密度。英國馬爾文儀器公司的MasterSize2000型激光粒度儀測土壤質地。氯仿熏蒸浸提法測定土壤微生物生物量(Vanceetal., 1987)。

2.3 土壤DNA提取及實時熒光定量PCR

土壤微生物DNA提取： 稱取0.3 g土壤，使用MOBIO POWERSOIL土壤提取試劑盒(MOBIO laboratories, Carlsbad, California, USA)，提取土壤總DNA。使用Nano Drop 2000熒光分光光度計測定土壤DNA，將符合要求的土壤DNA樣品保存在-80 ℃冰箱中備用。土壤氮循環各功能基因的定量PCR引物參見表2。

2.4 末端限制性片段長度多態性(T-RFLP)

AOA的群落結構通過末端限制性片段多態性技術(T-RFLP)進行分析。AOB由于豐度較低，未能通過PCR擴增獲得足量的PCR產物用于T-RFLP群落結構分析。AOA的擴增引物為CrenamoA23f/CrenamoA616 r。使用Bio-Rad公司的S-1000 PCR儀對土壤總DNA進行擴增。具體試驗參照胡行偉(2013)的方法。

表1 不同樹種人工林基本概況(均值±標準誤,n=3)①

表2 氮循環微生物定量PCR引物

2.5 克隆文庫和測序

AOAamoA基因的 PCR 擴增使用和T-RFLP分析相同的引物，引物不添加熒光標記。擴增產物回收后，連接到pGEM-T EasyVector 上，然后將載體轉化入大腸桿菌TOP10感受態細胞。從每個克隆文庫中隨機選擇50個克隆子進行測序，具體的克隆子選擇方法參考(Singhetal., 2011)。所獲得的目的基因序列通過MEGA 6.0 建立 neighbor-joining tree 進行系統發育分析(Tamuraetal., 2013)。本研究所獲得的序列信息全部上傳到GenBank數據庫，其中AOAamoA基因序列的編號從MH141588到MH141591。

2.6 數據處理

利用Excel 2016和SPSS19.0軟件進行統計分析。利用單因素方差分析(ANOVA)和多重比較法(LSD)計算不同樹種植物特性、土壤基本理化性質、微生物生物量和氮循環功能微生物基因拷貝數的差異顯著性。通過Pearson相關系數檢驗不同樹種植物特性與土壤理化性質之間的關系。對各樹種森林土壤氮循環功能微生物基因拷貝數與土壤理化性質進行Pearson相關分析。計算各樹種森林土壤之間AOA TRFs相對豐度的Bray-Curtis指數，然后利用非度量多維測度法(NMDS)觀察樣品之間AOA 群落結構的差異，通過Per MANOVA來檢測不同樹種森林土壤之間AOA群落結構差異的顯著性。

3 結果與分析

3.1 土壤理化性質

5種人工林土壤基本理化性質(黏粒和粉粒含量、密度、pH值及全氮、碳氮比、銨態氮含量)均無顯著差異(表3)。木荷林土壤砂粒含量顯著高于杉木和閩楠林(P<0.05)； 杉木林、閩楠和木荷林土壤含水量顯著高于福建柏林； 福建柏林土壤全碳含量顯著高于杉木林； 木荷林和火力楠林的土壤硝態氮含量顯著高于閩楠林和福建柏林； 火力楠林土壤礦質氮含量顯著高于閩楠林。

3.2 土壤微生物生物量

火力楠和木荷林的土壤微生物生物量碳(MBC)顯著高于閩楠和杉木林(P<0.05)(圖1)。火力楠、木荷和福建柏林的土壤微生物生物量氮(MBN)顯著高于閩楠和杉木林(P<0.05)。火力楠和木荷林的微生物生物量碳/氮(MBC/MBN)顯著高于杉木林(P<0.05)。在5個人工林土壤微生物生物量(MBC、MBN)中，火力楠和木荷林的均最高，而閩楠和杉木林的均最低。

表3 各樹種人工林土壤基本理化性質(均值±標準誤,n=3)

下同。 The same below.

3.3 土壤理化性質與微生物生物量的相關性

對5種人工林的Pearson相關分析表明(表3)，土壤全碳含量與植物細根碳含量極顯著正相關(P<0.01)； 土壤全氮含量與細根碳含量顯著正相關(P<0.05)； 土壤碳氮比與凋落物碳、細根碳含量顯著正相關(P<0.01)； 土壤NO3--N含量與凋落物木質素、纖維素含量顯著負相關(P<0.05)； MBC與凋落物木質素、纖維素含量極顯著負相關(P<0.01)； MBN與凋落物木質素、纖維素含量顯著負相關，而與細根碳含量顯著正相關(P<0.05)。

表3 各樹種森林土壤理化性質及微生物生物量的Pearson相關分析①

圖2 各樹種土壤氮循環相關功能微生物基因豐度(均值±標準誤,n=3)

3.4 氮循環功能微生物基因豐度

采用定量Q-PCR 檢測5種人工林土壤固氮、硝化和反硝化微生物基因豐度，根據標準曲線計算出土壤氮循環功能微生物基因拷貝數量(圖2)。5種人工林土壤固氮微生物nifH基因拷貝數無顯著差異(P>0.05)。5種人工林土壤AOAamoA基因拷貝數變化范圍為1.56×105～2.5×106copies·g-1soil，AOBamoA基因拷貝數變化范圍為3.70×104～1.4×105copies·g-1soil。5種人工林土壤AOAamoA基因拷貝數差異顯著，其中木荷林的顯著高于閩楠、火力楠和福建柏林(P<0.05)。5種人工林土壤AOBamoA基因拷貝數僅木荷顯著高于福建柏(P<0.05)。5個樹種之間，木荷的AOA和AOBamoA基因拷貝數均最高。5個樹種土壤AOA/AOB由高到低排序依次為木荷(17.75)、杉木(10.13)、火力楠(8.52)、福建柏(8.38)和閩楠(2.01)。nirS基因拷貝數變化范圍為3.39×104～1.86×105copies·g-1soil，木荷林顯著高于火力楠、杉木和福建柏林(P<0.05)。5種人工林土壤narG、nirK和nosZ基因的拷貝數均無顯著差異。閩楠林真菌ITS基因拷貝數顯著高于木荷(P<0.05)。5種人工林土壤細菌16S rRNA基因拷貝數均無顯著差異(P<0.05)。

3.5 土壤氮循環功能微生物基因豐度與土壤理化性質的關系

將5個樹種森林土壤氮循環微生物基因拷貝數和土壤理化性質進行Pearson相關分析(表4)，表明土壤全碳和土壤AOAamoA顯著負相關(P<0.05)； 土壤碳氮比與土壤AOAamoA極顯著負相關(P<0.01)； 土壤pH值與土壤AOBamoA、narG、nosZ顯著正相關(P<0.05)； 土壤NH4+-N含量與土壤AOAamoA顯著負相關(P<0.05)； 土壤NO3--N含量與土壤AOAamoA極顯著正相關(P<0.01)。

表4 各樹種土壤氮循環功能微生物基因拷貝數與土壤理化性質的Pearson相關分析

圖3 各樹種土壤氨氧化古菌AOA amoA群落結構的系統發育分析

3.6 氨氧化古菌群落結構的系統發育和T-RFLP分析

通過對5種森林土壤AOAamoA基因PCR產物進行酶切，分析其群落結構(圖3)。限制性酶切片段主要由RFs-205、RFs-202、RFs-157、RFs-164和RFs-76所組成。各樹種森林土壤中的AOAamoA屬于Nitrosopumilus和Nitrososphaera類群。使用HpyCH4V限制性內切酶對AOAamoA基因PCR產物進行酶切，能夠產生4個TRFs，其中TRF-76和TRF-165 是最主要的2個片段類型，分別占總片段的54.88%～100%、0～45.12%(圖4)，其中TRF-76屬于Nitrososphaera類群，TRF-165屬于Nitrosopumilus類群。TRF-76和TRF-165的相對豐度對不同樹種的響應非常明顯，閩楠的TRF-76相對豐度為100%，木荷、杉木、福建柏的TRF-76顯著降低； TRF-165的相對豐度在杉木土壤中最高，在閩楠中未檢出TRF-165。TRF-86只在福建柏人工林中檢出。TRF-156只在木荷人工林中檢出。

圖4 各樹種土壤氨氧化古菌AOA amoA基因T-RFs的相對豐度

圖5 各樹種土壤AOA群落結構的非度量多維測度(NMDS)分析

通過非度量多維測度法(NMDS)分析兩兩樣品之間的Bray-Curtis相似性指數(圖5)。AOAamoA的群落結構在樹種水平上未出現明顯分離。進一步PerMANOVA分析發現，不同樹種土壤AOAamoA的群落結構差異未達到顯著性水平(P>0.05)。

4 討論

4.1 各樹種森林土壤理化性質及微生物生物量的特征

不同樹種凋落物質量不同，決定了凋落物分解速率的差異(Zhangetal., 2015)，從而影響土壤碳、氮庫(萬曉華等， 2014)。本研究發現福建柏林的土壤全碳含量顯著高于杉木林，這可能由于福建柏凋落物碳氮比、木質素含量顯著低于杉木，細根碳含量顯著高于杉木(表1)，其凋落物及細根分解速率較快。木荷和火力楠林的土壤硝態氮含量顯著高于閩楠和福建柏林，土壤硝態氮含量與凋落物木質素、纖維素含量顯著負相關(表3)。這可能由于閩楠和福建柏林凋落物的難分解物質(木質素、纖維素)含量較高，微生物難以分解利用進而將氮素釋放出來。在森林生態系統中，硝態氮的淋失和反硝化是土壤氮素損失的重要途徑(Huygensetal., 2008)。木荷和火力楠林的土壤硝態氮庫較大，這表明該樹種可能不利于土壤氮保留。

不同森林類型土壤微生物生物量存在顯著差異。杉木連栽導致土壤中酚類物質累積，從而抑制土壤微生物生物量和活性(李秋玲等， 2012)。本研究發現，火力楠和木荷林的MBC顯著高于閩楠和杉木林，火力楠、木荷和福建柏林的MBN顯著高于閩楠和杉木林。Pearson相關分析可知，MBC與木質素、纖維素含量極顯著負相關； MBN與木質素、纖維素含量顯著負相關，而與細根碳含量顯著正相關。凋落物的木質素和纖維素含量顯著影響土壤微生物生物量。

4.2 不同樹種對氮循環相關功能微生物基因豐度的影響

沈秋蘭等(2016)研究發現，毛竹(Phyllostachyedulis)林土壤固氮微生物nifH基因拷貝數顯著高于闊葉林，土壤氮素水平明顯提高。但本研究5種森林土壤的固氮微生物nifH基因拷貝數并無顯著差異，這與Reverchon等(2015)的研究結果一致。這可能和各樹種森林土壤pH值無顯著差異有關，大部分土壤固氮細菌數量受土壤pH值影響較大，有其最適合的土壤pH值范圍(周移國等， 2013)。

He等(2007)對中國南方不同施肥處理下酸性紅壤的調查發現，AOA 在數量上占絕對優勢，AOA與 AOB比值的范圍從1～12。本研究中5種森林土壤中AOA基因豐度顯著高于AOB豐度，且AOA/AOB>2，與AOB相比，AOA在酸性森林土壤中更有優勢，這與李永春等(2014)研究結論相符合。土壤pH值是影響氨氧化微生物分布的最主要因素，Nicol等(2008)發現在pH值范圍4.9～7.5內，隨土壤pH值降低，AOA基因拷貝數及表達活性升高。本研究相關分析發現AOB豐度與土壤pH值顯著正相關，而AOA與土壤pH值并無顯著相關性。這可能與5種人工林土壤pH值無顯著差異且樣本數量少有關。Zhang等(2012) 通過穩定性同位素探針技術(DNA-SIP)研究發現，AOA而非AOB主導了酸性土壤中的硝化作用。本研究土壤NO3--N含量與AOA極顯著負相關，而與AOB無顯著相關性，這可能是因主要由AOA驅動了酸性森林土壤氨氧化過程。木荷的AOA 豐度顯著高于閩楠、火力楠和福建柏，AOB豐度顯著高于福建柏。這可能意味著木荷土壤的硝化作用在5種人工林中表現最強，加劇硝態氮淋溶和經反硝化作用氣態氮損失的風險，不利于氮保留。

反硝化功能微生物中narG、nirK和nosZ的基因拷貝數在5種森林土壤間均無顯著差異，這可能由于5種森林土壤的基本理化性質差異不顯著。木荷林nirS的基因拷貝數顯著高于火力楠、杉木和福建柏林，這可能和木荷林土壤的AOA、AOB豐度最高有關。Ribbons等(2016)研究發現，AOA和AOB基因拷貝數的總和與反硝化功能基因nirK與nirS的基因拷貝數的總和之間顯著正相關，氨氧化微生物通過硝化作用將銨態氮轉化成硝態氮，為反硝化作用提供底物，從而增加反硝化微生物基因豐度。Zhang等(2018)研究發現，潛在的反硝化速率和nirK、nirS基因豐度密切相關。反硝化作用是氮素損失的重要途經，木荷林土壤nirS的基因拷貝數顯著高于火力楠、杉木和福建柏林，這可能使木荷林土壤的溫室氣體(N2O、NO)排放量較高，不利于森林生態系統的氮保留。

5種森林土壤真菌ITS基因豐度只有閩楠林顯著高于木荷林，這可能因為閩楠林的凋落物，難以被微生物分解利用。與之相反，Ribbons等(2016) 研究發現，ITS基因豐度在不同樹種和樣地間均無顯著差異。Petersen等(2012)發現細菌16S rRNA基因豐度和總氮礦化速率顯著相關，但本研究中5種森林土壤的16S rRNA基因豐度沒有顯著差異。

4.3 不同樹種對土壤氨氧化古菌群落結構的影響

通過克隆和測序發現AOA類群屬于Nitrosopumilus和Nitrososphaera，其中TRF-76占總片段的54.88%～100%，屬于Nitrososphaera，占絕對優勢。本研究結果與前人結果相似，Zhang等(2012)發現，Nitrososphaera在強酸性土壤(pH<4.5)的硝化作用中發揮著重要作用。早有研究報道酸性土壤中存在屬于Nitrosopumilus的AOA類群(Heetal., 2007)。

本研究用HpyCH4V限制性內切酶對AOAamoA基因PCR產物進行酶切，僅得到4個TRFs。胡行偉(2013)對澳大利亞桉樹(Eucalypusspp.)林土壤中AOA使用RsaI限制性內切酶得到12個TRFs。TRFs數量不同可能是由于生態系統類型不同所致，也可能是內切酶的不同。李永春等(2014)發現不同林分通過土壤速效鉀、pH值和有機質含量引起土壤AOA群落結構顯著差異。但本研究發現不同樹種的AOA群落結構無顯著差異，可能是由于不同樹種的土壤pH值、TN、C/N、 NH4+-N含量沒有顯著差異，且微生物群落結構對環境因子改變的響應滯后造成的。Prescott等(2013)認為，樹種對土壤的影響具有較強環境依賴性，樹種效應可能在肥沃或中等肥力水平的土壤中更易檢測到。Ribbons等(2016)認為，樹種的影響小于立地，因此需要未來在同質園或更嚴格試驗條件下研究樹種對土壤氮保留的影響。

5 結論

在5種亞熱帶森林的酸性土壤中，氨氧化古菌AOA在數量上占據優勢地位，在土壤硝化作用中可能發揮著主導作用，木荷林的AOA和AOB豐度最高，nirS的基因豐度顯著高于火力楠、杉木和福建柏林，木荷林的AOA豐度顯著高于閩楠林，可能加劇氮素從森林生態系統損失的風險。5種森林土壤的AOA類群屬于Nitrosopumilus和Nitrososphaera，AOA群落結構無顯著差異。