毛竹四倍體誘導及初步鑒定*

徐鵬飛 楊艷紅 張毓婷 陳 云 湯定欽

(浙江農(nóng)林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室 杭州 311300)

毛竹(Phyllostachysedulis)是一種大型的多年生常綠散生竹類，具有生長快、繁殖強、成材早、用途廣、投資少收益大等特點。據(jù)全國第八次森林資源清查統(tǒng)計(國家林業(yè)局， 2014)，目前我國竹林面積601萬hm2，其中毛竹林443萬hm2，毛竹在竹林面積中所占比例巨大。在針對毛竹的研究中，遺傳育種是相對薄弱的環(huán)節(jié)，原因在于毛竹開花間隔周期長達60年以上，期間以無性繁育構建了克隆群體，這限制了人們對其遺傳基礎的研究，難以進行選擇、雜交育種等多世代的遺傳改良。我國毛竹林在世界竹業(yè)發(fā)展中占據(jù)重要地位，發(fā)展毛竹林是發(fā)展林業(yè)的重大措施，隨著我國竹產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，竹子資源利用還面臨不少問題，其中最為突出的是新品種的缺乏，無法滿足竹產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的需求。

多倍化對植物進化與新物種形成具有重要的意義，是選育新品種的重要手段之一。研究結果表明： 多倍體植株是由于染色體的加倍而成，其根、莖、葉、花、果實等多表現(xiàn)出增大、活性成分含量提高，植株抗逆性增強等顯著特征。藥用植物杭白芷(Angelicadahurica) 多倍體含有的歐前胡素比正常植株高2倍(彭菲等， 2002)； 白術(Atractylodesmacrocephala) 四倍體過氧化物含量比二倍體植株明顯增加(程心文等， 2003)； 甜葉菊(Steviarebaudiana) 四倍體葉片中糖甙含量比二倍體增加4.9%(陳紹潘，1995)； 四倍體西瓜(Citrulluslanatus) 耐鹽性明顯比二倍體強(劉文革等， 2002)； 四倍體青菜(Brassicachinensis) 的耐熱性要高于二倍體植株(張建軍等，1998)。迄今竹子多倍體的誘導僅見通過流式細胞儀等方法在花藥離體培養(yǎng)中鑒定出了叢生竹種麻竹(Dendrocalamuslatiflorus) 六倍體、十二倍體植株(李海營等， 2011)，散生竹未見報道。

植物多倍體人工誘導方法可分為物理誘導與化學誘導。物理誘導方法由于誘導率低、效果不穩(wěn)定等因素已逐漸不被采用(陶抵輝等， 2007)。常用于化學誘導的試劑有各種植物堿、麻醉劑、生長劑、激動素、抗生素等，其中秋水仙素是誘變多倍體效果最好的藥劑之一(彭靜等， 2010)，常見的誘導法有浸泡法、滴液法和混培法等(杜艷偉等， 2011)。秋水仙素抑制了細胞有絲分裂時期紡綞絲的合成，因而在其后期染色單體分裂時沒有紡綞絲向細胞兩極牽引而不能形成細胞板，細胞不分裂就形成了染色體加倍的細胞(Soltisetal.， 1989)。因此，利用秋水仙素誘導植物多倍體多選擇處理有絲分裂的細胞，如莖尖、根尖、幼葉、頂芽等這些分裂最旺盛的植物組織(Wuetal., 2015)，其中種子誘導率和存活率均顯著高于莖尖和愈傷組織(Ainaetal., 2012)。研究表明： 0.5 g·L-1的秋水仙素水溶液浸漬甘菊(Chrysanthemumlavandulifolium)種子12 h，誘導率達到23.0%(莫官站等， 2010)，1 g·L-1的秋水仙素溶液浸漬萌動的有斑百合(Liliumconcolorvar.pulchellum)種子，誘導率高達44.4%(張錫慶等， 2017)。

本研究以毛竹種子為材料，研究不同秋水仙素濃度及時間處理對毛竹染色體加倍的效果，并觀察毛竹多倍體早期的性狀表現(xiàn)，以期建立一套高效的毛竹多倍體誘導及快速、準確的倍性鑒定方法，為毛竹新品種選育提供優(yōu)新種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料及預處理

毛竹種子于2017年9月采自廣西壯族自治區(qū)靈川縣同一母株，半同胞種子在其種胚完成發(fā)育、后熟后采收。在不傷害到胚的前提下剝?nèi)シN殼，篩選出發(fā)育飽滿的種子。在超凈工作臺中利用70%(V/V)的乙醇種子表面消毒30 s、無菌水漂洗3次，再用2%(V/V)次氯酸鈉溶液浸泡種子10 min、無菌水漂洗3次后，用質(zhì)量分數(shù)0.1%的GA20溶液浸泡種子24 h進行催芽。

1.2 多倍體誘導方法

經(jīng)預處理的毛竹種子，分別用質(zhì)量濃度0.1、0.5、1、2 g·L-1的秋水仙素(國藥集團化學試劑有限公司)溶液誘導處理24、48、72 h，無菌水為空白對照，每組處理30粒種子，各設3個重復。處理結束后，用無菌水洗3～4次，濾紙擠干水分，接種到經(jīng)無菌處理的培養(yǎng)皿濾紙上培養(yǎng)。待種子露白，觀察記錄種子下胚部膨大情況后，再將露白的種子播種于土壤培養(yǎng)穴中。設置培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為： 溫度(25±1)℃，光照強度2 000 lx，光周期12 h光照/12 h 黑暗。

1.3 流式細胞儀測定DNA相對含量

生物體的單倍體基因組所含 DNA 總量稱為C值。在植物學研究中，流式細胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)可用于檢測植物細胞核DNA含量及其倍性水平，計算公式： 待測樣本核DNA含量或倍性水平=參照樣本核DNA含量或倍性水平×(待測樣本G0或G1熒光均值/參照樣本G0或G1熒光均值)(Dolezeletal., 2007)。

待毛竹幼苗長至七葉一心期開始分蘗后，按CyStain UV Precise T 試劑盒(Sysmex Partec, 德國)操作說明，在培養(yǎng)皿中加入450 μL的Nuclei Extraction Buffer，以剛抽出未展開的幼嫩葉片為材料，用刀片迅速切碎以保證細胞充分釋放，靜置3 min使其與細胞提取液充分結合后，加入1 800 μL染色液， 200目細胞篩過濾后，靜置5 min，在流式細胞儀(CYHOW PA，德國PARTEC)上進行檢測，參數(shù)按常規(guī)的設定。其中，每株上母株和側枝的嫩葉都要測，并且每個樣重復測3次。測定每個樣品時，先用水稻‘日本晴’(Oryzasativa‘Nipponbare’)進行校對后才開始測定； 同時每次的倍性篩選時選擇‘日本晴’和二倍體毛竹作為對照，以提高所得結果的可靠性。誘導率=多倍體植株數(shù)量/誘導處理種子數(shù)量。

1.4 氣孔密度和保衛(wèi)細胞大小測定

待植株生長6個月后，分別選取3株長勢良好的四倍體與二倍體植株，截取與對照二倍體植株相同位置成熟葉片的中部，使用次氯酸離析法(張立榮等， 2009)制片，每個植株隨機選10個視野和10個氣孔拍照， 20倍物鏡下觀察統(tǒng)計。

1.5 光合作用的測定

待植株生長8個月后，參照吳海燕等(2019)方法，于晴天9∶00—11∶00，選取長勢良好的3株二倍體與四倍體植株，然后每株選取從頂端起第3片成熟葉子，每個葉子采用LI-6400光合儀(Li-COR, 美國)測定，重復3次，使用自然光，溫度(25± 2)℃。

1.6 植株形態(tài)測定

毛竹幼苗在培養(yǎng)穴中生長30天后，將四倍體和二倍體毛竹幼苗煉苗移栽至大棚中,生長60天后，分別選取長勢健壯的四倍體和二倍體毛竹各5株，對株高、葉片大小等進行觀察記錄。

葉長(cm)： 葉片基部到葉尖的長度，測量每株竹苗從頂端起的第3個成熟葉片。

葉寬(cm)： 葉片最寬部分的橫向長度，測量每株竹苗從頂端起的第3個成熟葉片。

株高(cm)： 母株頂端到地面的距離。

1.7 統(tǒng)計分析

采用 SPSS17.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，Duncan法進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

圖1 不同倍性毛竹植株流式細胞儀檢測結果

2.1 多倍體植株的鑒定

由于植物多倍體中的細胞含有倍增的染色體數(shù)，其細胞中的總DNA含量也相應地倍增,通過流式細胞儀可以較為簡便地實現(xiàn)多倍體的鑒定。首先從已知的水稻的C值數(shù)據(jù)庫(http:∥www.ricedata.cn/variety/)查得‘日本晴’DNA含量為2C=1 pg，而后利用公式計算待測樣品的C值=(待測樣品的平均峰值÷‘日本晴’水稻的平均峰值)×1 pg。由圖1可知，水稻‘日本晴’的DNA含量峰值位于13道的位置左右，二倍體毛竹DNA含量其峰值約為50道,四倍體植株的DNA含量峰值位于100道的位置左右，說明誘導得到的植株細胞核DNA含量有成倍增加，通過C值的換算公式，可以確定為四倍體。如果DNA含量在50與100道處都有峰值，則表明植株為混倍體(王麗艷等， 2004； 張虹等， 2017)。分別用0.1、0.5、1、2 g·L-14種不同濃度的秋水仙素溶液浸泡經(jīng)預處理的毛竹種子24、48和72 h后，誘導結果見表1。誘導處理1 080粒毛竹種子，栽培后共得到204株植株，其中具有下胚軸膨大現(xiàn)象的種苗有92株(圖2)，經(jīng)流式細胞儀檢測倍性，除去出現(xiàn)雙峰的混倍體植株，共獲得15株四倍體植株。由表1可知，當秋水仙素濃度為0.5 g·L-1、處理時間為72 h，及秋水仙素濃度為1 g·L-1、處理時間為24 h時，四倍體的誘導率分別達4.44%和5.56%，誘導效果最佳。而用低于0.1 g·L-1濃度的秋水仙素處理種子時無明顯誘導效果，說明誘導毛竹多倍體需要一定的秋水仙素濃度。當秋水仙素濃度≥2 g·L-1，隨著浸泡作用時間增長，植株的存活率及多倍體誘導率都明顯下降。

表1 不同秋水仙素處理組合對毛竹種子四倍體誘導的影響①

圖2 經(jīng)秋水仙素處理后毛竹種子生長期下胚軸膨大現(xiàn)象

2.2 葉片保衛(wèi)細胞大小及密度觀察

已有的研究結果表明，氣孔、保衛(wèi)細胞、運動細胞的大小和葉綠體數(shù)目與倍性成顯著正相關，氣孔密度與倍性成顯著負相關(張紅亮等， 2012)。經(jīng)過觀察對比發(fā)現(xiàn)(表2，圖3)，誘導成的四倍體毛竹的葉下表皮氣孔保衛(wèi)細胞顯著大于二倍體植株(P<0.05)，并且葉下表皮氣孔密度顯著小于二倍體植株(P<0.05)。這也從細胞形態(tài)結構的角度證實了誘導的四倍體植株的真實性。

表2 毛竹二倍體與四倍體植株氣孔大小及密度的比較

圖3 毛竹二倍體與四倍體氣孔保衛(wèi)細胞

2.3 不同倍性毛竹光合速率的差異

毛竹四倍體植株的光合速率高于二倍體，大約是二倍體植株的1.21倍(圖4)，說明染色體加倍的毛竹植株在光合特性方面要優(yōu)于普通的二倍體植株。

圖4 不同倍性毛竹葉片的光合速率

2.4 不同倍性植株形態(tài)比較

與二倍體對照相比，四倍體植株表現(xiàn)為植株健壯、株高增高(圖5A、C)，葉片長度和寬度都有所增加(圖5B、D、E)

圖5 毛竹二倍體與四倍體的形態(tài)特征

3 討論

Winkler(1916)在研究龍葵(Solanumnigrum)嫁接時從其愈傷組織得到了四倍體植物，首先引入了多倍體這一概念。Blakeslee等(1937)首次發(fā)現(xiàn)用秋水仙素誘導多倍體的方法，此方法已經(jīng)在經(jīng)濟作物、觀賞植物、藥用植物等方面得到了廣泛的運用。目前對植物進行多倍體誘導是獲取新品種的最有效育種方法之一(Kunitakeetal.， 1998； 蔣淑磊等， 2015； 張宏宇等， 2019)。

研究表明，只有在一定濃度范圍以及合適的處理時間內(nèi)，秋水仙素才可以有效地誘導植物多倍體的發(fā)生。秋水仙素的毒性作用與使用的濃度和處理時間成正比，往往認為秋水仙素濃度接近于半致死濃度時，誘導多倍體效率最高(羅靜等， 2005)。秋水仙素誘導濃度過低，其對植物材料的誘導效果就不明顯，并且產(chǎn)生混倍體的幾率也就越大。適宜的處理時間可以使足夠的藥量進入誘導材料的細胞內(nèi)而且又不傷害細胞本身，處理時間過短則可能造成秋水仙素無法完全作用于植物材料，處理時間過長則可能對植物材料產(chǎn)生較大的毒害作用，增加其死亡率。

本研究參考了相關文獻，也經(jīng)過大量的前期試驗驗證，濃度從7、6、5、4、3、2、1 g·L-1到0.1 g·L-1，時間從8、12、24、48 h到72 h，每個梯度都做過嘗試，最終發(fā)現(xiàn)在秋水仙素濃度超過5 g·L-1時對毛竹的致死率幾乎是百分之百，而低濃度短時間處理其效果不明顯。因此，在經(jīng)過反復的試驗后，最終確定了處理濃度(0.1、0.5、1、2 g·L-1)和時間(24、48、72 h)的組合，并且在后續(xù)的試驗中也驗證了這個組合是比較理想的，特別是在濃度0.5 g·L-1處理48 h以上和1 g·L-1處理12 h以上都誘導出了四倍體。在關于秋水仙素誘導植物多倍體中，誘導出的植株以三倍體和四倍體居多，如三倍體西瓜(豆峻嶺等， 2015)、四倍體桑(Morusalba)(Chakrabortietal., 1998)等，也有八倍體和十二倍體，如八倍體柳枝稷‘京稷31’(Panicumvirgatum)(吳海燕等， 2019)、十二倍體羅田甜柿(Diospyroskaki)(谷曉峰等， 2003)。雖然本研究僅成功誘導出15株四倍體毛竹，但這無疑為毛竹育種增加了新的種質(zhì)資源。

植物多倍體的直接的鑒定方法通常分為染色體計數(shù)和細胞DNA含量測定等(王麗艷等， 2004； 費希同等， 2014)。其中，通過流式細胞儀測定細胞中的DNA總量，這種方法不僅具有快速、簡便、準確等優(yōu)點，還能夠檢驗出混倍體(王麗艷等， 2004； 張虹等， 2017)。細胞學和形態(tài)學特征，如氣孔的密度及其保衛(wèi)細胞的大小(Abaketal., 1998; Becketal., 2003)、植株的高生長和光合效率等(Liuetal., 2007; Tangetal., 2010)，也被用于倍性測定的間接指標。由于毛竹染色體數(shù)量較多(陳瑞陽等， 2003)，筆者在對多倍體毛竹進行鑒定時，主要采用流式細胞儀測定法，并通過該方法鑒定了15株四倍體； 在這基礎上，通過比較二倍體和四倍體間氣孔密度及保衛(wèi)細胞的大小、植株的高生長和葉片的光合效率等細胞學和形態(tài)學特征，發(fā)現(xiàn)毛竹四倍體確實發(fā)生了“巨大化”現(xiàn)象(韋榮昌等， 2013； 洪陳潔等， 2014)，這也間接地證實了獲得毛竹四倍體的可靠性。

4 結論

多倍體的誘導是重要而高效的植物育種技術，但迄今還沒有關于人工誘導毛竹同源多倍體的報道。本研究利用秋水仙素對毛竹種子進行多倍體誘變處理，經(jīng)流式細胞儀檢測等方法對處理后的植株進行DNA相對含量測定，結果表明共獲得15株四倍體毛竹。秋水仙素濃度為0.5 g·L-1、處理時間為72 h，及秋水仙素濃度為1 g·L-1、處理時間為24 h時，誘導效果最佳。四倍體植株與二倍體植株相比，其株高增加，葉片變長增寬，光合效率也明顯提升。綜上，利用秋水仙素誘導處理毛竹種子可為毛竹新品種的選育提供新的種質(zhì)資源。