紅樹林生境產嗜熱纖維素酶芽孢桿菌的篩選及其活性分析

胡 芮，孫曉暉，楊淼森，唐 旭，徐長安*，賈若琨*

(1.東北電力大學化學工程學院，吉林 吉林 132000； 2.自然資源部第三海洋研究所，福建 廈門 361005)

我國擁有豐富的纖維素資源，但大部分的纖維素資源還未被有效的利用，如果能夠利用合理的手段將大部分纖維素資源開發與轉化，將會在一定程度上解決能源問題[1-2]。據報道，木質纖維素生物質開發第二代生物乙醇具有許多優點，生物乙醇對于替代傳統石油化工產品存在巨大潛力[3-4]。有研究表明，纖維素酶降解生物質纖維的過程中包括3種酶的共同催化作用，多種酶通過切割纖維素中的β-1,4-葡萄糖苷鍵，最終將生物質纖維分解成可發酵的單糖[5]。纖維素酶在洗滌、造紙、醫藥等眾多領域有廣泛應用[6-7]，未來隨著生物燃料的商業化生產，酶的需求量將大大增加[8]。目前，產業化生產用的纖維素酶主要來源于微生物，真菌作為纖維素酶的主要來源，具有產量高、活性高、易于分離和提取等優勢[9]；與之相比，細菌由于其生長周期短，具有產酶速度快等優點，且細菌來源的纖維素酶比真菌來源的纖維素酶更為穩定，以中性或者酸性為主[10-11]，被認為是產業化生產纖維素酶的主要菌[7,9]。如芽孢桿菌(Bacillus)作為水產微生態制劑的常用菌，在養殖池底泥中更易形成優勢菌群，且能分泌多種酶類降解水環境中污染物，凈化水質。

紅樹林由于其特殊的地理位置，有規律地受到海水浸泡和露空，隨著大量的植物殘體和落葉的堆積，不斷地為微生物提供纖維素等物質[12]，因此，從紅樹林生境獲得產纖維素酶菌株具有廣泛的研究前景。本研究以紅樹林沉積物樣品為實驗材料，采用羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)水解圈法篩選具有纖維素酶活性的芽孢桿菌，旨在為纖維素酶微生態制劑的開發和相關應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及培養基

本研究細菌基因組DNA提取試劑盒購自上海賽百盛基因技術有限公司；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)生化鑒定試劑盒購自山東拓普生物工程有限公司；胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast Extract)購自生工生物工程股份有限公司；葡萄糖(分析純)購自西隴化工股份有限公司；CMC-Na購自國藥集團化學試劑有限公司；剛果紅購自西隴科學股份有限公司；三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液(Tris-HCl)購自索來寶科技有限公司，DNS試劑、Mcllvaine緩沖溶液購自廈門市綠茵試劑玻儀有限公司。

產纖維素酶培養基：CMC-Na 10 g，KNO31 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂17 g，H2O 1 000 cm3，pH=7.0。

LB培養基：Tryptone 10 g，Yeast Extract 5 g，NaCl 10 g，H2O 1 000 cm3，pH為7.2～7.4(固體LB培養基中添加瓊脂15 g)。

1.2 主要儀器

實驗主要儀器包括超凈工作臺 SW-CJ-1FD(蘇州凈化有限公司)、生化培養箱(寧波萊福科技有限公司)、多功能酶標儀 SpectraMax M5(美國美谷分子有限公司)、滅菌鍋 GR85DF(美國致微儀器有限公司)、pH計BP-10(德國賽多利斯集團)、顯微鏡DM750(德國萊卡儀器有限公司)、透射電子顯微鏡JEM-1230(日本電子株式會社)。

1.3 樣品的采集及預處理

本實驗樣品采自中國福建漳州紅樹林生態保護區(24°12′～25°44′N，116°50′～118°02′E)的底泥沉積物和動植物，取6份不同樣品各稱取約0.5 g溶于體積分數為0.9%的5 cm3無菌生理鹽水中，經80 ℃水浴10 min后按照梯度稀釋并涂布于LB培養基，挑取單菌落進行劃線分離培養。

1.4 實驗方法

1.4.1 產纖維素酶菌株初篩 待篩菌株接種于LB培養基，在37 ℃、180 r/min下培養12 h備用；在產纖維素酶培養基平板中心打出8 mm直徑的小孔，加入50 mm3菌液，正置于37 ℃生化培養箱中培養1～2 d，至菌體生長蔓延到孔外；在長出菌體的平板上滴加1 mg/cm3剛果紅溶液至覆蓋滿整個平板，10 min后，傾去剛果紅溶液，加入4 mol/dm3的NaCl溶液，10 min后傾去NaCl溶液，菌體周圍出現的透明圈即為纖維素酶水解圈。

1.4.2 菌株復篩及酶活性測定方法 初篩水解圈較大的菌株接種于LB培養基，于37 ℃、180 r/min下活化過夜，后按體積分數5%接種量接種于100 cm3LB培養基中發酵24 h后離心(10 000 r/min，6 min)，離心所得上清液即為粗酶液，于4 ℃下保存備用。

纖維素酶活性測定參照文獻[13-15]的測定方法，在10 cm3刻度試管中加入稀釋酶液 0.2 cm3(3支平行樣)，再各吸取 0.8 cm3體積分數為1%的 CMC-Na溶液(pH=5.0)，搖勻，于40 ℃條件下水浴 10 min，取出冷卻至室溫，加入1.5 cm3DNS 試劑，迅速混勻后于沸水浴中反應 10 min，冷卻后，加去離子水定容至10 cm3，輕輕上下搖勻，另取0.2 cm3稀釋酶液和0.8 cm30.1mol/dm3Mcllvaine緩沖溶液作為空白，不加CMC-Na溶液，同樣按照上述步驟，用空白調零點，于554 nm下測其吸光度。

1.5 菌株鑒定

1.5.1 菌株的初步鑒定 觀察待鑒定菌株所形成的菌落特征及革蘭氏染色前后顯微鏡下的菌體形態,并進行菌株的理化性質分析[16]。

1.5.2 16S rDNA 基因序列分析及鑒定 提取篩選菌株基因組DNA，以16S rDNA 基因保守序列27F:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′為引物進行PCR擴增，并對篩選的菌株進行鑒定[17]。將測得的菌株16S rDNA 基因序列在GenBank數據庫中進行比對分析，并利用MEGA 5.1軟件構建系統發育樹。

1.6 菌株產酶性質研究

吸取10 cm3菌液于離心管中，在4 ℃、10 000 r/min轉速條件下離心10 min，分別對菌液、上清液及10 cm350 mmol/dm3Tris-HCl(pH=7.0)緩沖液中的重懸菌株于500 W下超聲破碎25 min，分別測定各組分的纖維素酶活性。

1.7 不同條件下粗酶液酶活性的測定

1.7.1 最適溫度測定 酶活性單位(U)定義：即在下列酶反應條件下每分鐘由底物產生1 μmol還原糖的酶量作為1個酶活單位U。將粗酶液與1%的CMC-Na溶液(pH=5.0)以1∶4的體積比混合，分別于不同溫度(30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85 ℃)條件下進行反應并測定纖維素酶活性，得出酶促反應的最適溫度。

1.7.2 最適pH測定 將粗酶液與1%不同pH的CMC-Na溶液(pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)以1∶4的體積比混合，并于最適溫度下測定纖維素酶活性，得出酶促反應的最適pH。

1.7.3 金屬離子對酶活性影響的測定 分別添加100 mm310 mmol/dm3的Mn2+、Fe3+、Zn2+、Mg2+和Cu2+于反應液中，并于最適溫度和pH下測定纖維素酶活性。

2 結果與討論

2.1 芽孢桿菌屬菌株產纖維素酶情況分析

根據菌株分離結果，共獲得52株芽孢桿菌屬菌株。通過產纖維素酶平板測試，根據水解圈大小(直徑)對產纖維素酶菌株進行初篩，其中水解圈大于30 mm有4株，水解圈介于20～30 mm有15株，水解圈小于20 mm有8株，無水解圈有25株，不同菌株產酶情況如圖1所示。

圖1 紅樹林樣品中芽孢桿菌屬不同菌株產酶情況Fig.1 Cellulase production of Bacillus strainsfrom mangrove samples圖中百分數為不同產酶情況菌株數目占總菌株數目的比例；A表示無水解圈，B表示水解圈直徑<20 mm，C表示水解圈直徑為20～30 mm，D表示水解圈直徑>30 mm。

2.2 纖維素酶活性復篩

根據水解圈大小及菌株的生長狀況選擇4 株菌株, 分別進行搖瓶復篩并測定粗酶液酶活性，相應結果見表1。其中編號為ms-2 的菌株在此條件下生長較快, 水解圈直徑大小為26.776 mm(圖2)，因而選用此菌株作進一步的研究。

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 菌株的初步鑒定 將菌株ms-2劃線于TSA(枯草芽孢桿菌生化鑒定試劑盒自帶)平板上，于37 ℃培養18～24 h后發現菌落呈淺褐色、不規則、扁平、干燥有褶皺形態。透射電鏡顯示菌體為直狀或近直狀的桿菌，長2.38～4.19 μm，粗0.7～0.9 μm，多為兩個或兩個以上菌體鏈狀連接，如圖3(a、b)所示；革蘭氏涂片染色結果呈陽性，菌體兩端鈍圓且呈桿狀，單個或少量鏈狀存在；有芽孢，芽孢端生或中生[圖3(c)]；菌株ms-2的生化特征見表2。

表1 纖維素酶活性復篩分析

圖2 菌株ms-2纖維素酶水解圈Fig.2 Picture of cellulase hydrolysis rings by ms-2 strain

圖3 菌株ms-2透射電子顯微鏡圖像與革蘭氏染色鑒定結果Fig.3 Identification of ms-2 strain by transmission electron microscope and Gram staining圖(a、b)左下角數據為透射電子顯微鏡圖片自帶放大倍數，圖(c)是普通電子顯微鏡，不帶放大倍數。

2.3.2 16S rDNA 基因序列分析及鑒定 16S rDNA基因比對結果表明，該基因片段與多株枯草芽孢桿菌相似性達99%(圖4)，綜合上述的菌株理化分析結果，鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌，將本研究篩選的菌株ms-2命名為枯草芽孢桿菌ms-2。

表2 菌株ms-2生理生化性質鑒定分析

圖4 基于16S rDNA構建的菌株ms-2系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of ms-2 strain based on 16S rDNA

2.4 菌株產酶性質分析

取細菌菌液、發酵上清液和細胞裂解液，分別檢測各組分的纖維素酶活性。如圖5所示，菌液和發酵上清液中的纖維素酶活性無顯著差異，細胞裂解液幾乎無活性。結果表明該菌株所產纖維素酶為胞外酶而非膜錨定酶；細胞顯示的微弱活性，可能來自于胞內翻譯完成但尚未完成轉運過程的纖維素酶前體物質。

圖5 菌液、細胞和上清液纖維素酶活性檢測結果Fig.5 Results of cellulase activity in bacterium liquid, supernatant and cell pellet

2.5 粗酶液酶學性質分析

2.5.1 溫度對酶活性的影響 如圖6所示，粗酶液的活性隨著溫度升高呈穩定提高的趨勢，并于65 ℃時到達最高；而后隨著溫度升高而降低，當溫度達到75 ℃時，仍保留60%的活性；此后，隨著溫度上升，酶活性迅速下降，當溫度到達85 ℃時，酶活性下降到27%。結果表明該酶最適宜溫度為65 ℃，具備一定的熱穩定性，屬于嗜熱酶。

圖6 酶活性隨溫度的變化結果Fig.6 Changes of enzyme activity with temperature

2.5.2 pH對酶活性的影響 在最適溫度65 ℃下，pH對粗酶液酶活性的影響如圖7所示，酶活性隨著pH的上升而逐漸上升，于6.0時達到最大值，而后隨著pH的上升而逐漸下降，最適pH為6.0左右。pH對酶活性的影響結果表明，pH介于5.0～7.0之間酶活性達到最大酶活性的84%以上；在pH=3.0時，酶活性達到最大酶活性的16%以上。表明該菌株ms-2所產纖維素酶為弱酸性酶。在最適溫度和pH條件下，該菌株所產纖維素酶的最高酶活性為0.655 7 U/cm3。

圖7 酶活性隨pH的變化結果Fig.7 Changes of enzyme activity with pH

2.5.3 金屬離子對酶活性的影響 如圖8所示，在濃度分別為1 mmol/dm3Cu2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+和Mn2+的脅迫下，Cu2+對酶促反應無顯著影響，Mg2+、Zn2+、Fe3+和Mn2+對酶促反應均有不同程度的抑制作用，酶活性分別下降2.84%、5.75%、9.49%和29.96%，其中Mn2+對酶活性的抑制效果最為明顯。

圖8 金屬離子對纖維素酶活性的影響Fig.8 Impact of metal ions on the cellulase

2.6 討論

紅樹林是分布于熱帶和亞熱帶位于陸地和海洋交界的灘涂地帶，是陸地向海洋過渡的特殊生態系統[18]，由于紅樹林落葉等木質纖維素的沉積，產纖維素酶微生物也是該區的重要生物組成部分[19-21]。本研究通過對52株來源于紅樹林沉積物樣品的芽孢桿菌屬菌株進行產纖維素酶平板測試，結果表明，產纖維素酶的菌株共有27株，25株無纖維素酶活性；另外，通過產蛋白酶平板測試，發現這27株既有纖維素酶活性也有蛋白酶活性，另外25株中23株有蛋白酶活性，2株既沒有蛋白酶活性也沒有纖維素酶活性，它們通過多種功能協同作用，共同形成細菌群落并完成功能分工。因此，從紅樹林生境獲得產纖維素酶菌株具有廣泛的研究前景。

真菌、細菌和放線菌為常見的產纖維素酶微生物，其中，由于芽孢的存在，具有芽孢的細菌在耐酸、耐堿、耐高溫等方面有獨特的優勢，因此成為目前研究產纖維素酶微生物的一個重要方向。如芽孢桿菌作為水產養殖業常用菌種，其可以直接應用于養殖水體或添加到飼料中使用，具有耐酸、耐鹽和耐高溫等特性，特別是水產顆粒料加工時對菌體無顯著影響，因此，芽孢桿菌在這方面具有明顯的優勢。不同菌株所產生的纖維素酶也有一定的差異性，Irfan等(2017)通過對嗜熱菌株枯草芽孢桿菌K-18產纖維素酶條件進行分析，初步確定了該酶的最適溫度為50 ℃，最適pH為7.0[22]；張耿崚等(2017)從嗜熱菌資源豐富的溫泉區土壤中篩選出一株具有纖維素酶活性的嗜熱地芽孢桿菌(Geobacillussp.)HTA426，通過對該菌株產酶能力進行分析，其酶活性在溫度為60 ℃和pH為7.0條件下達到最高[23]；Li等(2008)通過對溫泉中分離得到耐熱產纖維素酶的枯草芽孢桿菌產酶條件分析，發現該菌株產酶最適反應溫度為50 ℃，此時酶活性為0.26 U/cm3[24]。目前，產嗜熱纖維素酶菌株大多來源于溫泉、活火山口附近等環境[25]；此外，紅樹林生境篩選出纖維素酶活性較高的菌株還是以真菌為主[26-27]，且絕大多數細菌產的纖維素酶最適反應溫度在55 ℃左右[28]。本研究從紅樹林生境篩選出的枯草芽孢桿菌ms-2最適宜溫度為65 ℃，與其他報道的研究成果相比[28-29]，該酶具有良好的嗜熱性，且兼具較高的酶活性。由于產業應用中酶解纖維素時通常需要在55～60 ℃的溫度下進行，研究獲得的嗜熱纖維素酶不僅適合這樣的溫度環境，還能在酶活性上維持較高的水平，有利于產業開發應用。

對纖維素酶基因的克隆始于20世紀70年代，目前為止大量纖維素酶基因已被克隆出來，并采取一系列技術手段來提高纖維素酶的活性和產量[30]。研究表明，纖維素酶基因序列具有種屬相似性[31]。基于此，我們將在后續工作中進一步對枯草芽孢桿菌ms-2進行纖維素酶基因克隆和重組表達，用于產業化生產與應用。

3 結論

本研究通過篩選得到一株具有較高纖維素酶活性的枯草芽孢桿菌ms-2，并對其粗酶液進行分析，結果顯示最適宜溫度和pH分別為65 ℃和6.0，在此條件下最高酶活性為0.655 7 U/cm3，此外，該酶對Cu2+穩定，Mg2+、Zn2+、Fe3+和Mn2+等金屬離子對該酶具有抑制作用。綜上所述，該菌所產纖維素酶為嗜熱的弱酸性胞外酶，因而具有良好的應用潛力。