葛根素聯(lián)合唑來(lái)膦酸對(duì)維甲酸誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松大鼠的治療作用①

徐 鵬，唐華羽

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥( postmenopausalosteoporosis，PMOP)，是60歲及以上女性人群的常見(jiàn)病，屬于骨骼代謝病。由于中年女性年紀(jì)增加導(dǎo)致其卵巢功能衰竭，繼而引發(fā)雌性激素分泌水平下降，從而打破成骨細(xì)胞以及破骨細(xì)胞之間的平衡，引發(fā)骨形成小于骨吸收。具體表現(xiàn)為骨量的下降與骨組織的顯微結(jié)構(gòu)退行性變?yōu)樘卣鱗1]。在維甲酸誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松模型中，維甲酸可引起生殖系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p傷，造成大鼠體內(nèi)雌激素水平下降導(dǎo)致大鼠高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松。即增加成骨細(xì)胞的活性與數(shù)量，相應(yīng)的增加破骨細(xì)胞的活性，但對(duì)促進(jìn)破骨細(xì)胞的數(shù)目與活性的作用要遠(yuǎn)大于成骨細(xì)胞，這與人類PMOP具有良好的相似性[2，3]。由于體內(nèi)雌激素水平下降，引起骨質(zhì)疏松的同時(shí)并對(duì)生殖系統(tǒng)造成了相應(yīng)的損傷[4]，因此激素替代治療成了首選，但通過(guò)傳統(tǒng)的雌激素療法，將會(huì)引發(fā)乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢增生等嚴(yán)重問(wèn)題，存在相應(yīng)的危險(xiǎn)性[5]，因此使用植物性雌激素替代傳統(tǒng)的雌激素治療PMOP得到了專家們的重視，成為目前的研究熱點(diǎn)之一。

因此，本研究在唑來(lái)膦酸治療骨質(zhì)疏松的基礎(chǔ)之上使用葛根素，觀察是否存在加強(qiáng)治療效果的作用。為臨床上治療絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松患者，提供可供參考的治療方案及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取40只健康雌性SD大鼠(SPF級(jí)，由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。許可證號(hào)：SCXK-(遼)2015-0001)12周齡，體重180～220g。室內(nèi)飼養(yǎng):溫度20～25℃、相對(duì)濕度40%～70%、每日光照12h、通風(fēng)良好。

1.1.2 主要試劑：維甲酸(含量99.4%)，購(gòu)于北京建強(qiáng)偉業(yè)科技有限公司。葛根素(含量98%)及唑來(lái)膦酸，均購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器：Micro-CT(美國(guó)GE公司)、全自動(dòng)生化分析儀(上海維鏑生物科技公司)、低溫離心機(jī)(中佳公司)、病理切片機(jī)(上海徠卡儀器公司)、正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康)、包埋機(jī)(武漢俊杰電子公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥

將40只雌性SD大鼠隨機(jī)分別為空白組、模型組、唑來(lái)膦酸組、聯(lián)合組，每組10只。將各組大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水、攝食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1W后開始建模。造模時(shí)，除空白組外其余各組每日給予維甲酸100mg/(kg·d)進(jìn)行灌胃，空白組每日給予維甲酸等量的蒸餾水進(jìn)行灌胃，建模14d后，各組根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行給藥，唑來(lái)膦酸組與聯(lián)合組給予7mg/kg的劑量各注射一次，其余各組給予等量的生理鹽水進(jìn)行注射。其中，聯(lián)合組每日給與葛根素50mg/(kg·d)進(jìn)行灌胃，其余各組給予等量的蒸餾水進(jìn)行灌胃，連續(xù)給藥10周。

1.3 組織樣品采樣與指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 血清樣品采集：給藥結(jié)束后，大鼠每只眼眶靜脈采集5mL血液，離心，取上清置于冰箱凍存，已備后用。

1.3.2 骨骼組織指數(shù)測(cè)定：栓塞法處死大鼠后用手術(shù)剪從大鼠腹部正中剪開，迅速找到大鼠股骨，剔除周圍肌肉韌帶組織后，PBS沖洗2次，用無(wú)塵無(wú)菌紙將PBS吸干，采用Micro-CT掃描股骨遠(yuǎn)端生長(zhǎng)板下方4mm為感興趣區(qū)掃描，檢測(cè)出股骨骨小梁的微結(jié)構(gòu)(骨組織體積比、骨小梁厚度、骨小梁分離度、骨小梁數(shù))。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 股骨端骨顯微參數(shù)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，治療10周后的大鼠股骨遠(yuǎn)端Micro-CT掃描結(jié)果如圖1所示。與空白組進(jìn)行比較，模型組大鼠股骨的骨組織形態(tài)計(jì)量參數(shù)發(fā)生了顯著的改變。骨體積分?jǐn)?shù) (BV/TV) 、骨小梁數(shù)量 (Tb.N) 和骨小梁厚度 (Tb.Th) 顯著降低(P<0.01)，骨小梁分離度(Tb.Sp)顯著增加(P<0.01)，與唑來(lái)膦酸組與聯(lián)合組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合給藥組股骨BV/TV、Tb.Th及Tb.N大于唑來(lái)膦酸組(P<0.05)。骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)顯示，葛根素與唑來(lái)膦酸能夠恢復(fù)骨質(zhì)疏松大鼠股骨骨小梁的厚度，表明葛根素對(duì)骨再生具有協(xié)同作用。

Sham組 模型組 唑來(lái)組 聯(lián)合組

sham組 模型組型 唑來(lái)組 聯(lián)合組

圖1 各組骨微結(jié)構(gòu)的改變(Pa<0.05,與sham組比較；Pb<0.05，與模型組比較；PC<0.05與唑來(lái)膦酸組比較)

圖2 S-Ca與S-P的變化(Pa<0.05,與sham組比較；Pb<0.05，與模型組比較；PC<0.05與唑來(lái)膦酸組比較)

2.2 血清鈣、磷水平

結(jié)果與空白組進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，模型組S-Ca與的S-P水平顯著升高(P<0.05)，經(jīng)葛根素、唑來(lái)膦酸治療后，S-Ca，S-P均降低，聯(lián)合治療組S-P低于單獨(dú)給藥組(P<0.05)，而S-Ca無(wú)顯著意義(P>0.05)。聯(lián)合治療組血清鈣、磷的含量與空白組相似，(P>0.05)見(jiàn)圖2。上述結(jié)果表明葛根素對(duì)大鼠骨質(zhì)疏松血鈣、血磷具有協(xié)同作用。

2.3 各組股骨頭鏡下組織結(jié)構(gòu)比較

空白組股骨頭周圍骨皮質(zhì)厚而密，骨髓腔大小適中，骨皮質(zhì)小梁結(jié)構(gòu)粗大、致密并且排列整齊，骨髓腔中脂肪細(xì)胞數(shù)量較少，骨細(xì)胞形態(tài)正常，骨陷窩壁與骨細(xì)胞貼合緊密，沒(méi)有間隙。模型組組織整體結(jié)構(gòu)較其他3組異常改變，骨髓腔中可見(jiàn)大量脂肪細(xì)胞增生，骨小梁數(shù)目明顯減少，各類原始細(xì)胞數(shù)量明顯減少，明顯呈骨質(zhì)疏松表現(xiàn)；與模型組比較，唑來(lái)膦酸組組織整體結(jié)構(gòu)輕度異常，骨髓腔中脂肪細(xì)胞數(shù)量較模型組有所減少，各類原始細(xì)胞數(shù)量增多。聯(lián)合組股骨頭周邊骨皮質(zhì)較厚與骨小梁均勻平排列，小梁之間間隙變小，骨細(xì)胞與骨陷窩之間沒(méi)有明顯的間隙。骨質(zhì)疏松病理現(xiàn)象明顯改善。見(jiàn)圖3。

圖3 各組股骨組織結(jié)構(gòu)(HE染色×100 黑色箭頭所示脂肪細(xì)胞，紅色箭頭所示骨小梁)

3 討論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠骨切片整體結(jié)構(gòu)異常，骨髓腔中骨小梁的數(shù)量明顯減少，大量脂肪細(xì)胞增生；各類原始細(xì)胞數(shù)量減少，并呈現(xiàn)骨質(zhì)疏松的典型表現(xiàn)，說(shuō)明研究模型制作成功。PMOP是一種骨質(zhì)中減少有機(jī)成分，碳酸鈣及磷酸鈣下降，骨微結(jié)構(gòu)受損，從而導(dǎo)致骨強(qiáng)度下降，骨脆性增大，易于發(fā)生骨折的骨骼性疾病，是最常見(jiàn)的代謝骨病之一[6]。2016年我國(guó)老年骨質(zhì)疏松患病率達(dá)到36%，其中老年女性達(dá)到49%，表明代謝性骨質(zhì)疏松在本國(guó)發(fā)病率明顯上升[7]。在臨床治療上，對(duì)于代謝性骨病往往以孕激素、雌二醇來(lái)治療代謝性骨質(zhì)疏松，通過(guò)提高體內(nèi)的雌激素水平，從而刺激成骨細(xì)胞的活性，糾正骨代謝異常[8,9]，逐步緩解生殖系統(tǒng)萎縮。但長(zhǎng)期使用化學(xué)類激素，易引起心血管內(nèi)壁的損傷及生殖系統(tǒng)癌變等嚴(yán)重問(wèn)題，具有一定的風(fēng)險(xiǎn)性[2,10]。

本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用Micro-CT是一種對(duì)骨組織微結(jié)構(gòu)數(shù)值及骨密度測(cè)量的新型技術(shù)，多用于PMOP的測(cè)定及抗骨質(zhì)疏松藥物的評(píng)價(jià)。本次實(shí)驗(yàn)探究唑來(lái)膦酸、葛根素兩種藥物。葛根素具有雌激素的作用，是一種異黃酮類化合物，其能有效促進(jìn)成骨細(xì)胞的生成，對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠起到骨保護(hù)作用。唑來(lái)膦酸療效確切，能夠明顯的抑制骨吸收的功能，能夠抵抗破骨細(xì)胞所產(chǎn)生的降解骨無(wú)機(jī)鹽的作用，藥物副作用小，由于與骨礦鹽結(jié)合能力強(qiáng)，導(dǎo)致藥物半衰期長(zhǎng)，臨床患者治療只需1年注射1次，這樣大大地解決了患者的用藥順從性問(wèn)題[11]。因此，唑來(lái)膦酸在臨床上被應(yīng)用廣泛。本研究結(jié)果顯示，唑來(lái)膦酸聯(lián)合葛根素的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ凸墙Y(jié)構(gòu)參數(shù)及血磷，與單獨(dú)應(yīng)用唑來(lái)膦酸相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明葛根素可以發(fā)揮類雌激素的作用，在唑來(lái)膦酸診治骨質(zhì)疏松的基礎(chǔ)之上，能夠加強(qiáng)治療效果。

綜上所述，葛根素與唑來(lái)膦酸，對(duì)于維甲酸誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型體內(nèi)的骨形成具有協(xié)同作用。葛根素聯(lián)合唑來(lái)膦酸可以是治療及預(yù)防骨質(zhì)疏松的有效方案，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。