蛇床子提取物對(duì)小鼠陰道菌群影響的研究①

孫盛梅,溫達(dá)靜,趙東旭,周海瑞,于春楊,郭 靖,董子鈺

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

健康女性陰道存在多種微生物，與人體內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和免疫機(jī)制、陰道內(nèi)酸堿度處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。在正常女性陰道微生態(tài)中乳酸桿菌占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，大量研究表明，乳酸桿菌分解多種糖類產(chǎn)生大量細(xì)菌素及表面活性劑來(lái)抑制致病菌，通過(guò)產(chǎn)生乳酸及過(guò)氧化氫等物質(zhì)調(diào)整陰道內(nèi)環(huán)境。當(dāng)陰道內(nèi)感染致病菌，并迅速增殖，出現(xiàn)菌群失調(diào)，此時(shí)乳酸桿菌減少或不變，喪失優(yōu)勢(shì)地位，單一抑制細(xì)菌而不糾正陰道菌群失衡狀態(tài)，治療后陰道仍然處于易感狀態(tài)，這是陰道炎癥復(fù)發(fā)的主要原因。

蛇床子為傘形科植物，取成熟的果實(shí)，干燥后入藥，對(duì)心血管系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等都有優(yōu)異的保護(hù)作用。胡玉紅、張燕等[1]研究表明：蛇床子中酚類物質(zhì)、單菇醇等物質(zhì)對(duì)陰道菌群有抑菌作用，其有效成分主要來(lái)自蛇床子揮發(fā)油。毛櫻逾等[2]研究表明蛇床子不影響乳酸桿菌的產(chǎn)酸能力，甚至提高乳酸桿菌的產(chǎn)酸能力。蛇床子有止癢作用，能有效緩解頑固性外陰瘙癢,有顯著的治療效果[3]。由于陰道微生態(tài)中多種微生物共存，乳酸桿菌與金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、大腸桿菌等微生物相互抑制、相互依存，因此，在菌群失調(diào)模型的治療中，療效單一的藥物很難達(dá)到治療目的。因此，本實(shí)驗(yàn)主要探究蛇床子提取物在拮抗陰道中致病菌：金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和大腸桿菌的作用，以及對(duì)乳酸桿菌的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種和材料

菌種：大腸桿菌、白色念珠菌和金黃色葡萄球菌，以及乳酸桿菌菌種均由佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物中心提供。蛇床子：購(gòu)自佳木斯中醫(yī)院藥店。培養(yǎng)基：MRS選擇性培養(yǎng)基，血瓊脂平板、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基等購(gòu)自環(huán)凱微生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

昆明小鼠160只，雌性、體重范圍在(15±2)g，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藥物提取和菌種活化

蛇床子提取物的制備：蛇床子50g，粉碎,過(guò)20目篩,用75%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液浸泡后進(jìn)行超聲提取，每次1h，間隔分為3次進(jìn)行，置于4℃，調(diào)整到8000rpm，離心10min，紗布過(guò)濾,所得濾液回收乙醇,并濃縮至50mL,即得1g/mL質(zhì)量濃度的藥液，分裝備用[4]

將四種實(shí)驗(yàn)菌種分別轉(zhuǎn)種活化、接種到各自增菌培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)24～48h，其中乳酸桿菌置于厭氧罐中培養(yǎng)，用滅菌環(huán)形接種環(huán)挑取培養(yǎng)基表面的單個(gè)菌落，導(dǎo)入盛有生理鹽水的試管中攪拌、充分震蕩，分別制成0.5麥?zhǔn)蠞岫然鞈乙篬5]。

1.3.2 體外探究蛇床子提取物的MIC值

取96孔細(xì)菌培養(yǎng)板，標(biāo)記分組。A、B、C、D四排分別標(biāo)記為乳酸桿菌組、大腸桿菌組、白色念珠菌組和金黃色葡萄球菌組。從左至右依次編號(hào)為：1～10號(hào)。A、B、C、D組1號(hào)孔加入小牛血清150μL，2～10號(hào)孔均加入小牛血清100μL，A、B、C、D組1號(hào)孔加入蛇床子提取物藥液50μL，采用倍比稀釋法將1號(hào)孔的藥物2倍稀釋直至第8孔，每組1～9孔定量加入對(duì)應(yīng)0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?00μL，最終1～9號(hào)孔對(duì)應(yīng)的藥物濃度分別為：125.00g/L，62.50g/L，31.25g/L，15.63g/L，7.81g/L，3.91g/L，1.95g/L；0.98g/L ，9號(hào)孔為陽(yáng)性對(duì)照孔，10號(hào)孔為空白對(duì)照孔。恒溫 37℃，培養(yǎng) 24～48h，置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，觀察以無(wú)菌生長(zhǎng)孔所對(duì)應(yīng)的蛇床子提取物質(zhì)量濃度為最低抑菌濃度 (MIC值)，見(jiàn)表1。選取三種致病菌中最高的MIC值：7.81g/L，為第二階段動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中藥物的有效藥物濃度。

1.3.3 蛇床子提取物對(duì)小鼠陰道菌群的影響

創(chuàng)建小鼠陰道菌群失調(diào)模型：隨機(jī)將160只小鼠分為四組：1號(hào)乳酸桿菌組、2號(hào)大腸桿菌組、3號(hào)白色念珠菌組和4號(hào)金黃色葡萄球菌組，每組40只。實(shí)驗(yàn)1～4號(hào)組，每組全部小鼠陰道內(nèi)均注入20μL該組對(duì)應(yīng)的菌懸液，連續(xù)5d。第7天采集1～4組陰道沖洗液，稀釋后分別接種到對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基，1號(hào)組置于厭氧袋中，37℃培養(yǎng)48h后菌落計(jì)數(shù)，連續(xù)檢測(cè)2d。從實(shí)驗(yàn)第9天起，將已建成的陰道菌群失調(diào)模型1～4號(hào)組內(nèi)再隨機(jī)分成兩組：對(duì)照組及治療組，每組20只。對(duì)照組每日用60μL生理鹽水沖洗陰道；治療組用60μL，質(zhì)量濃度為7.81g/L的蛇床子提取物藥液沖洗陰道，連續(xù)10d。療程結(jié)束后48h依照以上方法檢測(cè)各組小鼠陰道內(nèi)實(shí)驗(yàn)菌的菌落數(shù)，連續(xù)檢測(cè)2d。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)測(cè)得蛇床子提取物對(duì)大腸桿菌、白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的MIC值分別為3.91g/L、7.81g/L和3.91g/L。取三者最高M(jìn)IC值，即質(zhì)量濃度為7.81g/L的蛇床子提取物藥液，進(jìn)行小鼠菌群失調(diào)模型的治療。應(yīng)用蛇床子治療前，1～4號(hào)組各組內(nèi)對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組陰道菌落數(shù)對(duì)比(P>0.05)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明各組菌群失調(diào)模型間感染嚴(yán)重程度無(wú)差異。1號(hào)組中實(shí)驗(yàn)組乳酸桿菌治療前、后差距無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，對(duì)照組治療前、后無(wú)明顯變化，差距無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2；2號(hào)組中實(shí)驗(yàn)組大腸桿菌治療后較治療前明顯下降，差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì)照組治療后較治療前無(wú)明顯變化，差距無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3；3號(hào)組中白色念珠菌實(shí)驗(yàn)組治療后較治療前明顯下降，差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì)照組治療前、后無(wú)明顯變化，差距無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見(jiàn)表4；4號(hào)組中實(shí)驗(yàn)組金黃色葡萄球菌治療后較治療前相比明顯降低，差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì)照組治療前、后相比無(wú)明顯變化，差距無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表5。

表1 蛇床子提取物對(duì)4種實(shí)驗(yàn)菌種的影響(n=20)

表2 乳酸桿菌組中對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組給藥前、 后菌落數(shù)變化

表3 大腸桿菌組中對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組給藥前、 后菌落數(shù)變化

表4 白色念珠菌組中對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組給藥前、 后菌落數(shù)變化

表5 金黃色葡萄球菌組中對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組給藥 前、后菌落數(shù)變化

3 討論

本實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)可行，明確了蛇床子提取物對(duì)小鼠陰道3種常見(jiàn)致病菌的抑菌活性并測(cè)得各致病菌的MIC值。為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供理論支持，選取3種致病菌的最高M(jìn)IC值作為治療菌群失調(diào)模型的最適藥物濃度，起到預(yù)實(shí)驗(yàn)效果，避免直接動(dòng)物陰道內(nèi)注入不同濃度梯度的藥液，出現(xiàn)藥物濃度過(guò)高對(duì)小鼠陰道壁細(xì)胞的損傷，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)論。乳酸桿菌在本實(shí)驗(yàn)最高藥物濃度，即125g/L的藥液中仍能繼續(xù)生長(zhǎng)，且相關(guān)文獻(xiàn)表明蛇床子不影響乳酸桿菌的產(chǎn)酸能力甚至有增強(qiáng)作用。因此蛇床子提取物對(duì)乳酸桿菌的促進(jìn)作用顯而易見(jiàn)，綜合馮鋒, 楊建宏等[6]研究表明蛇床子提取物有止癢作用，能顯著提高磷酸組織胺致癢閾，且對(duì)解脲支原體的最低抑菌濃度為 62.5～125μg/mL，與本實(shí)驗(yàn)所得MIC值相符。楊小進(jìn)，張華菲等[7]研究表明： 乳酸桿菌對(duì)本實(shí)驗(yàn)3種受試菌有顯著抑菌作用。提高乳酸桿菌的優(yōu)勢(shì)地位，分解糖原產(chǎn)生乳酸及抑菌物質(zhì)，或通過(guò)生物奪氧方式、黏附機(jī)制和競(jìng)爭(zhēng)排斥作用抑制致病菌的繁殖，具有良好的抑菌作用[8]。綜合以上說(shuō)明蛇床子對(duì)于陰道炎癥的治療具有增加乳酸桿菌數(shù)目、提高乳酸桿菌產(chǎn)酸及抑菌能力、抑制解脲支原體、止癢等多重功效。對(duì)提高陰道炎臨床遠(yuǎn)期療效，實(shí)現(xiàn)單一藥物，多效、低毒、抑菌合并重建陰道微生態(tài)有臨床意義。