不同叢枝菌根真菌對(duì)廣藿香生長(zhǎng)及其揮發(fā)油積累的影響

劉 璐，馬俊卿，廖虹霖，孫晨瑜 ，王 勇，黃京華，

（1. 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院/廣西高校作物栽培學(xué)與耕作學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004；2. 植物科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，廣西 南寧 530004）

【研究意義】廣藿香〔Pogostemon cablin（Blanco）Benth.〕為唇形科刺蕊草屬植物，屬多年生草本，通常以其干燥的地上部分入藥，是為中藥廣藿香［1］。廣藿香是臨床上常用的芳香化濕藥，其味較辛，性微溫，歸脾、胃、肺經(jīng)，具有芳香化濁、和中止嘔、發(fā)表解暑等功效［2］。廣藿香作為一種廣東道地藥材，是多種著名中成藥如藿香正氣丸、藿膽丸等以及現(xiàn)代中藥制劑如抗病毒口服液的主要原料。由于廣藿香具有較高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其質(zhì)量和產(chǎn)量對(duì)其入藥至關(guān)重要。研究表明，多種植物對(duì)叢枝菌根顯出較強(qiáng)的依賴(lài)性，叢枝菌根（Arbuscular Mycorrhiza，AM）真菌能與陸地上80%以上的植物形成共生［3］，這其中也包括了多種藥用植物。AM真菌作為菌肥接種，可以促進(jìn)生長(zhǎng)、提高植物的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量、抗逆性、抗病性和次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量等，且AM真菌本身無(wú)毒無(wú)味，是一種純正的生物肥料［4］。【前人研究進(jìn)展】肖家欣等［5］研究發(fā)現(xiàn)，AM真菌不僅能顯著增加百喜草的株高、植株鮮重，還能顯著降低植株Zn、Fe、B、Cu含量。黃京華等［6］研究發(fā)現(xiàn)，摩西球囊霉（Glomus mosseae）和地表球囊霉（Glomus versiforme）均能顯著增加黃花蒿對(duì)N、P、K的吸收，提高其葉片葉綠素含量、蒸騰速率和地上生物量等。AM真菌還能提高藥用植物有效成分的含量，如AM真菌能提高丹參植株丹參酮的含量［7］；接種AM真菌可以顯著提高藥用植物黃檗中重要的藥用成分小檗堿、藥根堿及掌葉防己堿的含量［8］；黃花蒿接種AM真菌后青蒿素及其揮發(fā)油含量顯著提高［6］。冷平生等［9］研究發(fā)現(xiàn)，接種AM真菌不僅能減輕干旱對(duì)銀杏的危害，還能顯著提高銀杏萜類(lèi)內(nèi)酯含量。【本研究切入點(diǎn)】廣藿香這一藥用植物正面臨種質(zhì)資源衰竭、產(chǎn)品質(zhì)量下降等問(wèn)題，威脅到其入藥的安全性、穩(wěn)定性、有效性。目前對(duì)AM真菌與廣藿香共生的研究較少，本研究通過(guò)廣藿香接種AM真菌，研究其對(duì)廣藿香生長(zhǎng)和藥用有效成分的影響，以期達(dá)到提高質(zhì)量、增加產(chǎn)量，滿足用藥需要的目的。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)比較不同AM真菌接種下廣藿香的生長(zhǎng)情況、內(nèi)源激素變化及揮發(fā)油出油率等各項(xiàng)指標(biāo)，揭示AM真菌與廣藿香之間的共生效應(yīng)，為廣藿香的高產(chǎn)及高效栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試A M真菌為幼套近明球囊霉（Claroideoglomus etunicatum）和摩西管柄囊霉（Funneliformis mosseae），菌種購(gòu)自中國(guó)叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫(kù)（Bank of Glomeromycota in China，BGC，前者編號(hào)為BGC HEN02A，后者編號(hào)為BGC NM02A），試驗(yàn)所用接種劑由上述菌種按盆栽沙培法擴(kuò)繁而得［10］。廣藿香扦插苗由廣西那坡廣藿香種植基地提供。供試基質(zhì)為河沙、土壤（黃棕壤）、珍珠巖按5∶5∶1比例混合的盆栽基質(zhì)。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用盆栽的方法，于2019年4—11月在廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院（108°17′9.00″E，22°50′28.41″N）溫室中進(jìn)行，室內(nèi)保持在25 ℃、空氣濕度75%左右。試驗(yàn)設(shè)單接種幼套近明球囊霉（CE）、單接種摩西管柄囊霉（FM）和不接種對(duì)照3個(gè)處理，每個(gè)處理28次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1盆，做好標(biāo)記置于溫室中，完全隨機(jī)排列。將采用高溫滅菌法滅菌消毒18 h以上的盆栽基質(zhì)混合，采用一層基質(zhì)一層菌沙的處理方法填滿29 cm× 27 cm花盆，每盆用250 g菌沙。廣藿香苗采用直插法插入花盆中，每盆1個(gè)插穗。插后立即澆透水，每日定時(shí)淋水保持盆內(nèi)土壤濕潤(rùn)。由于廣藿香為全日照植物，陰雨天需對(duì)其進(jìn)行人工補(bǔ)光。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

廣藿香苗定植后，在整個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)，每隔31 d測(cè)定1次株高、莖粗。定植后31、93、155、217 d分別測(cè)定廣藿香菌根侵染率；廣藿香苗進(jìn)入快速生長(zhǎng)期后每隔31 d（即定植后93、124、155、186、217 d）采樣測(cè)定其地上部分干物質(zhì)量、內(nèi)源激素含量等指標(biāo)，每次采樣時(shí)每個(gè)處理隨機(jī)取3盆。廣藿香進(jìn)入成熟期后提取其揮發(fā)油并計(jì)算揮發(fā)油得率。

廣藿香株高用卷尺直接測(cè)量，莖粗用游標(biāo)卡尺測(cè)量，地上部分干物質(zhì)量用稱(chēng)重法測(cè)定，菌根侵染率用染色鏡檢法［11］，內(nèi)源激素用酶聯(lián)免疫吸附分析法，揮發(fā)油的提取用水蒸氣蒸餾法。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2019和SPSS20.0軟件進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種處理廣藿香菌根侵染率

試驗(yàn)結(jié)果表明，摩西管柄囊霉（FM）與幼套近明球囊霉（CE）均可與廣藿香共生形成叢枝菌根。圖1為AM真菌侵染廣藿香植株后在根段內(nèi)觀察到的孢子及泡囊結(jié)構(gòu)。由圖2可知，F(xiàn)M處理與CE處理的菌根侵染率均隨著廣藿香的生長(zhǎng)而逐漸上升，定植初期各處理的菌根侵染率均較低，CE、FM處理的菌根侵染率在定植后217 d達(dá)到最高，分別為78.33%、75.00%。在每個(gè)時(shí)期，F(xiàn)M、CE兩種接種處理均高于CK且差異均極顯著；CE處理的菌根侵染率均顯著高于FM處理，且定植后93 d差異達(dá)極顯著水平。

圖1 廣藿香根段內(nèi)孢子及泡囊Fig. 1 Spores and vesicles in the root of P. cablin

圖2 不同處理廣藿香菌根侵染率Fig. 2 Mycorrhizal infection rate of P. cablin under different treatments

2.2 不同接種處理廣藿香生長(zhǎng)情況

由表1可知，各處理廣藿香株高的增長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，均隨著時(shí)間的推移而逐漸增高，在整個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)，各處理株高表現(xiàn)為CE＞FM＞CK。廣藿香在定植后2～4個(gè)月進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，株高增長(zhǎng)速度最快，除定植后186、217 d之外，其他時(shí)期FM、CE處理株高與CK差異極顯著；定植后186 d，F(xiàn)M處理的株高與CK無(wú)顯著差異，而CE處理與CK差異顯著；定植后217 d，F(xiàn)M處理株高與CK無(wú)顯著差異，而CE處理與CK差異極顯著；FM、CE兩個(gè)接種處理間在定植后62、155 d均有顯著差異，其他時(shí)期則均無(wú)顯著差異。表明FM、CE兩種AM真菌都對(duì)廣藿香的株高增長(zhǎng)有促進(jìn)作用，但差異不大。

廣藿香基部莖徑的變化趨勢(shì)為前4個(gè)時(shí)期增長(zhǎng)迅速，而后3個(gè)時(shí)期增長(zhǎng)趨于平緩，CE、FM處理與CK基部莖徑均在定植后217 d達(dá)到最大值，分別為15.19、14.66、13.05 mm；除定植后62 d各處理基部莖徑大小表現(xiàn)為FM＞CE＞CK，其他時(shí)期表現(xiàn)為CE＞FM＞CK。其中，CE處理基部莖徑在所有時(shí)期與CK差異極顯著；FM處理與CK定植后186 d差異顯著外，其他時(shí)期均呈極顯著差異；CE處理與FM處理間除定植后93 d出現(xiàn)顯著差異外，其他時(shí)期均無(wú)顯著差異，表明這兩種AM真菌對(duì)廣藿香的基部莖徑增粗有一定的促進(jìn)效果，但差異較小。

2.3 不同接種處理廣藿香干物質(zhì)量變化

由圖3可知，兩組AM真菌接種處理廣藿香干物質(zhì)量均顯著高于對(duì)照。其中，CE處理除接種初期外，其他時(shí)期與CK均呈極顯著差異；FM處理除定植后186、217 d外其他時(shí)期與CK均呈極顯著差異；CE處理與FM處理間除定植后93、217 d存在顯著差異外，其余時(shí)期差異不顯著。表明接種AM真菌對(duì)廣藿香干物質(zhì)量具有顯著促進(jìn)作用，F(xiàn)M、CE處理的廣藿香干物質(zhì)量分別為CK的 1.21～1.70倍和 1.19～1.78倍。

2.4 不同接種處理廣藿香內(nèi)源激素變化

由表2可知，各處理廣藿香植株葉片IAA含量都呈先升后降的變化趨勢(shì)。FM處理IAA含量除最后收獲期外在每個(gè)時(shí)期均高于CK，在定植后93、155、186 d更是達(dá)到極顯著差異，最高時(shí)FM處理IAA含量比CK高59.2%，而CE處理與CK無(wú)顯著差異；FM處理與CE處理IAA含量除收獲期差異顯著外，其他時(shí)期差異均達(dá)極顯著。表明兩種不同AM真菌接種處理對(duì)廣藿香葉片IAA含量的影響不同，F(xiàn)M處理能顯著提高廣藿香葉片IAA含量，CE處理則無(wú)明顯影響。

表1 不同處理廣藿香生長(zhǎng)情況Table 1 Growth of P. cablin under different treatments

圖3 不同處理的廣藿香干物質(zhì)量Fig. 3 Dry matter weight of P. cablin under different treatments

表2 不同處理的廣藿香內(nèi)源激素變化Table 2 Changes of endogenous hormones in P. cablin under different treatments

不同處理廣藿香植株葉片ABA含量在定植后93～217 d變化趨勢(shì)不同。其中，CK為先上升后下降，最高含量與最低含量之間相差較大；FM處理為一直緩慢上升；CE處理為先緩慢上升后緩慢下降；FM、CE處理ABA最高含量較最低含量增長(zhǎng)不大。廣藿香定植后93、124、155 d，3個(gè)處理ABA含量依次為CK＞FM＞CE；定植后186、217 d，3個(gè)處理ABA含量依次為FM＞CE＞CK。定植后155 d，CK與CE處理ABA含量在達(dá)到峰值后開(kāi)始下降，而FM處理仍在繼續(xù)上升直到定植后217 d，說(shuō)明FM處理在生長(zhǎng)期內(nèi)延緩了ABA開(kāi)始快速產(chǎn)生的時(shí)間，延緩了對(duì)廣藿香生長(zhǎng)的抑制。

2.5 不同接種處理廣藿香揮發(fā)油含量變化

由圖4可知，接種AM真菌顯著提高了廣藿香的揮發(fā)油得率，且不同AM真菌對(duì)廣藿香揮發(fā)油得率的提高效果不同。至收獲時(shí)，F(xiàn)M處理?yè)]發(fā)油得率為2.06%，是對(duì)照（1.47%）的1.40倍，CE處理?yè)]發(fā)油得率為2.87%，是對(duì)照的1.95倍。方差分析結(jié)果表明，定植后155 d，CK與FM、CE處理間揮發(fā)油得率無(wú)顯著差異；定植后155 d，廣藿香植株開(kāi)始進(jìn)入完全成熟期，積累揮發(fā)油的速率加快，定植后186、217 d，CE處理與CK的揮發(fā)油得率差異極顯著，而FM處理?yè)]發(fā)油得率雖高于CK，但差異不顯著。

圖4 不同處理的廣藿香揮發(fā)油得率Fig. 4 Volatile oil yield from P.cablin under different treatments

3 討論

一直以來(lái)，本研究所選用的球囊霉屬的AM真菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)性與抗逆性［12］，并且分布廣泛。球囊霉屬的AM真菌是華南地區(qū)常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)屬［13］，侵染對(duì)象范圍廣，但不同AM真菌對(duì)同一植物的選擇性不同，而且差異較大［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，兩種AM真菌均能與廣藿香共生，且兩者與對(duì)廣藿香的侵染能力存在一定差異，以幼套近明球囊霉對(duì)廣藿香的侵染能力更優(yōu)。

AM真菌能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量［15-16］。Radheshyam等［17］發(fā)現(xiàn)AM真菌與植物促生菌共同作用通過(guò)提高植物的抗病性獲得了產(chǎn)量的增長(zhǎng)。Aroca等［18］發(fā)現(xiàn)AM真菌通過(guò)改變ABA在植物體內(nèi)的活動(dòng)，減輕逆境環(huán)境對(duì)植物生長(zhǎng)的不利影響。本研究中，廣藿香植株中的IAA含量也表現(xiàn)出隨著侵染率的逐步上升而提高，且含量顯著高于對(duì)照；ABA含量的增長(zhǎng)速率隨著侵染率的提高而減緩，且前期ABA含量顯著低于對(duì)照。研究表明，IAA具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、調(diào)運(yùn)養(yǎng)分的作用，而ABA的主要作用為抑制生長(zhǎng)、促進(jìn)脫落和休眠［19］。AM真菌接種使得廣藿香葉片內(nèi)的IAA含量提高，ABA含量降低，延長(zhǎng)了廣藿香生長(zhǎng)期，促進(jìn)廣藿香生長(zhǎng)和干物質(zhì)量的積累。

揮發(fā)油是廣藿香的主要藥用成分，自20世紀(jì)70年代開(kāi)始人們從廣藿香揮發(fā)油中分離出了廣藿香酮等抗真菌活性成分后［20］，揮發(fā)油的研究一直被人們所關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，AM真菌對(duì)藥用植物中藥效活性成分的積累有著積極作用［21-22］。例如，蒼術(shù)苗接種AM真菌后揮發(fā)油有效成分含量顯著提高［23］。本研究結(jié)果表明，接種AM真菌的廣藿香植株所提取出的揮發(fā)油顯著高于對(duì)照，且由于廣藿香對(duì)不同種AM真菌的選擇性不同，接種FM與CE對(duì)廣藿香揮發(fā)油積累的提升效果也不同，以CE處理的效果更佳。

本研究只是初步地探討了單接種不同AM真菌對(duì)廣藿香的影響，并未進(jìn)行混合菌接種的影響效應(yīng)研究，至于AM真菌對(duì)廣藿香揮發(fā)油中有效成分合成的影響機(jī)理，更需要從AM真菌對(duì)藥用有效成分在廣藿香植株內(nèi)分布的規(guī)律以及合成積累途徑中各種酶與次生代謝產(chǎn)物的影響等方面深入地研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，兩種AM真菌對(duì)廣藿香生長(zhǎng)都有促進(jìn)作用，且效果顯著。至收獲時(shí)，F(xiàn)M接種處理的廣藿香株高比對(duì)照高9.0%，基部莖徑比對(duì)照高9.8%，干物質(zhì)量比對(duì)照高21.4%，揮發(fā)油得率比對(duì)照高0.59個(gè)百分點(diǎn)；CE接種處理的廣藿香株高比對(duì)照高18.6%，基部莖徑比對(duì)照高14.4%，干質(zhì)比對(duì)照高51.4%，揮發(fā)油得率比對(duì)照高1.40個(gè)百分點(diǎn)。AM真菌侵染廣藿香后，促使廣藿香產(chǎn)生了更多內(nèi)源激素IAA，降低了ABA含量，且接種FM對(duì)IAA的促進(jìn)效果更好，而接種CE對(duì)ABA的抑制效果更好。綜合而言，CE對(duì)廣藿香的整體增益效果更好，且對(duì)于廣藿香產(chǎn)量中最重要的揮發(fā)油含量促進(jìn)效果明顯。