大鱗副泥鰍精液超低溫冷凍保存方法的優(yōu)化

喬瑞峰，陸專靈，高爽爽，雷 坤，韋友傳

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院/廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021）

【研究意義】大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus）屬鯉形目鰍科花鰍亞科副泥鰍屬［1］，是一種常見的小型經(jīng)濟(jì)魚類［2］，自然分布于長江、嘉陵江和岷江水系、遼河中下游、黃河及黑龍江地區(qū)［3］。其肉質(zhì)鮮美，蛋白質(zhì)含量高且脂肪含量較低［4］，具有補(bǔ)血益氣、壯陽利尿功效［5］，已成為我國近年新興的淡水養(yǎng)殖品種［6］。隨著大鱗副泥鰍養(yǎng)殖規(guī)模日益擴(kuò)大，人工育苗才能滿足苗種需求。然而，人工育苗多為近親交配，易產(chǎn)生種質(zhì)退化、遺傳多樣性下降和抗病抗逆性能降低等問題，嚴(yán)重影響大鱗副泥鰍養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。精液超低溫冷凍保存技術(shù)作為有效、持久的精子保存手段，方便苗種場之間運(yùn)輸和開展不同品種或品系以及不同地理種群間魚類的雜交［7］，發(fā)揮雜交優(yōu)勢，是解決近親交配問題的有效手段之一。【前人研究進(jìn)展】關(guān)于魚類精液超低溫冷凍保存的研究國內(nèi)外均有報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，10%甲醇與CCSE2稀釋液組合在黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）的精子超低溫冷凍保存中效果最好，凍精活力為42.86（±2.67）%［8］。美洲鰣魚（Alosa sapidissima）精液以魚用任氏液和10%（V/V）甲醇作為抗凍保護(hù)液，解凍后凍精活力可達(dá)80.3（±2.58）%［9］。缺簾魚（Brycon cephalus）精子超低溫保存以Ringers液為稀釋液、16%二甲亞砜為保護(hù)劑，解凍后精子活力為35.2（±4.5）%［10］。以D-15為稀釋液、10%乙二醇（EG）為抗凍劑，采用兩步降溫法超低溫冷凍保存翹嘴鲌（Culter alburnusBasilewsky）精子，解凍后精子活力為62.67%［11］。大鱗副泥鰍精液常溫（4 ℃、20～24 ℃）保存，精子活力保持時(shí)間較短（≤132 h）［13］，超低溫冷凍保存的凍精激活率為70%，但精子活力較低［12］。可見，不同魚類的精液超低溫冷凍保存方法存在差異。【本研究切入點(diǎn)】魚類精子超低溫保存方法較多，測定精子活力標(biāo)準(zhǔn)不一［9,12-13］，難以比較凍存效果。為此在前人魚類精子超低溫保存研究的基礎(chǔ)上，從不同稀釋液、抗凍劑及解凍后精子活力等方面探討大鱗副泥鰍精子冷凍保存的方法。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過篩選不同稀釋液和抗凍劑，優(yōu)化抗凍劑的體積分?jǐn)?shù)以及精液稀釋比例，探究適宜的精液超低溫冷凍保存方法，以期為大鱗副泥鰍的精液保存和生產(chǎn)應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2019年5—7月在廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院水產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試魚為二齡大鱗副泥鰍雄魚（100條），體長20.3（±2.4）cm，質(zhì)量78（±5）g，由廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院那馬基地贈(zèng)送。大鱗副泥鰍在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)兩周，水溫26（±2）℃，每天喂食1次商品顆粒飼料，確認(rèn)健康狀態(tài)良好后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 精液獲取與活力測定 選取健康狀況良好的雄魚采集精液。操作過程使用30 mg/L MS-222溶液對(duì)供試魚進(jìn)行麻醉處理，用毛巾擦干魚體水分后擠壓腹部采集精液（采集過程應(yīng)避免尿液、糞便和血漬污染）。為測定精子活力，取5 μL鮮精液和10 μL純水在載玻片上混勻，在400倍顯微鏡下觀察并記錄精子活力。精子活力（%）=呈直線運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)/精子總數(shù)×100［14］。經(jīng)鏡檢，精子活力達(dá)90%以上可用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 精液冷凍保存與解凍 將所需稀釋液與精液按一定比例混勻，加入所需體積分?jǐn)?shù)的抗凍劑，混勻后分裝于凍存管（1 mL/管）進(jìn)行超低溫冷凍。冷凍方法采用三步冷凍法：首先在液氮面上方6 cm處平衡10 min，然后在液氮面上平衡5 min，最后投入液氮中冷凍保存。解凍與凍精質(zhì)量的測定：打開液氮罐，將保存的精子從液氮中取出，于液氮口處平衡5 min后，37 ℃水浴快速解凍直至融化，立即取5 μL精液放入顯微鏡視野下，用純水激活觀察精子活力。

1.2.3 精液稀釋液篩選 為篩選大鱗副泥鰍精液超低溫冷凍保存的最佳稀釋液，參照相關(guān)文獻(xiàn)制備稀釋液Ⅰ（魚用任氏液）［9］、Ⅱ（Hanks精子保存液，由A液和B液組成，使用時(shí)各取5 mL，加入蒸餾水至 100 mL）［15］、Ⅲ［16］、Ⅳ［13,17］、Ⅴ［12］，各稀釋液具體配方見表1。稀釋液配制完成后置于4 ℃保存?zhèn)溆谩７謩e將5種稀釋液與精液以2∶1比例混合，然后加入甘油（終濃度5 %）作為抗凍劑（重復(fù)加樣3次），置于液氮罐冷凍保存，1周后檢測和比較各稀釋液的凍精活力。

表1 供試精液稀釋液配方Table 1 Formula of diluent for tested semen

1.2.4 精液抗凍劑篩選與優(yōu)化 為篩選大鱗副泥鰍精液超低溫冷凍保存的最佳抗凍劑，將最佳稀釋液與精液以2∶1比例混合，分為3組，分別加入抗凍劑二甲基亞砜（DMSO）、甘油（Gly）和甲醇（METH），終濃度均為5%（重復(fù)加樣3次），置于液氮罐冷凍保存，1周后檢測和比較凍精活力，篩選最佳抗凍劑。為優(yōu)化最佳抗凍劑體積分?jǐn)?shù)，將最佳稀釋液與精液以2∶1比例混合，分為8組，分別加入最佳抗凍劑，使最終體積分?jǐn)?shù)分別為2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%和20%，置于液氮罐冷凍保存，1周后檢測和比較凍精活力，確定最佳抗凍劑的最優(yōu)體積分?jǐn)?shù)。

1.2.5 精液稀釋比例優(yōu)化 確定最佳精液稀釋液和最佳抗凍劑的最佳體積分?jǐn)?shù)后，將精液與最佳精液稀釋液按照1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7和1∶8比例稀釋，加入最佳體積分?jǐn)?shù)的最佳抗凍劑（重復(fù)加樣3次），然后置于液氮罐冷凍保存，1周后檢測并比較凍精活力，確定精液與最佳稀釋液的最佳稀釋比例。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 20進(jìn)行單因素方差分析，采用Graphpad prism 8.0.1制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同稀釋液對(duì)精液超低溫冷凍保存效果的影響

圖1 不同稀釋液對(duì)精液超低溫冷凍保存效果的影響Fig. 1 Effects of different diluents on ultra-low temperature cryopreservation of semen

由圖1可見，稀釋液Ⅳ處理的凍精活力最高，達(dá)到35.5（±2.7）%，顯著高于其他4種稀釋液；稀釋液Ⅰ、稀釋液Ⅱ和稀釋液Ⅴ處理的凍精活力分別為22.3（±2.3）%、28.2（±2.2）%和24.1（±1.3）%，三者之間無顯著差異；效果最差的為稀釋液Ⅲ，凍精活力僅為15.2（±2.9）%。

2.2 不同抗凍劑及其體積分?jǐn)?shù)對(duì)精液超低溫冷凍保存效果的影響

由圖2可見，5% DMSO抗凍劑對(duì)大鱗副泥鰍精液的冷凍保存效果最好，精子活力為40.7（±2.5）%；甘油對(duì)精子冷凍保存效果最差，精子活力僅為24.8（±1.7）%。配制不同濃度的DMSO抗凍劑，比較不同濃度DMSO對(duì)精液超低溫冷凍保存的效果，結(jié)果（圖3）顯示，10% DMSO對(duì)大鱗副泥鰍精液的冷凍保存效果最好，凍精活力達(dá)54.6（±1.5）%；20% DMSO的冷凍保存效果最差，凍精活力僅為14.9（±2.4）%。

圖2 不同抗凍劑對(duì)精液超低溫冷凍保存效果的影響Fig. 2 Effects of different antifreeze on ultra-low temperature cryopreservation of semen

圖3 不同體積分?jǐn)?shù)DMSO對(duì)精液超低溫冷凍保存效果的影響Fig. 3 Effect of different volume fraction of DMSO on ultra-low temperature cryopreservation of semen

2.3 不同稀釋比對(duì)精液超低溫冷凍保存效果的影響

將精液與稀釋液Ⅳ以1∶1、1∶2、1∶3、1∶ 4、1∶5、1∶ 6、1∶7和1∶8體積比混合，DMSO（終濃度10%）為抗凍劑，比較不同稀釋比例對(duì)大鱗副泥鰍精液的冷凍保存效果。結(jié)果（圖4）顯示，精液與稀釋液以1∶3比例混合對(duì)精液的冷凍保存效果最好，精子活力達(dá)到65.4（±2.3）%；以1∶8比例混合對(duì)精液的冷凍保存效果最差，精子活力僅為17.4（±2.0）%。

圖4 不同稀釋比對(duì)精液超低溫冷凍保存效果的影響Fig. 4 Effect of different dilution ratio on ultra-low temperature cryopreservation of semen

3 討論

3.1 精子超低溫冷凍保存的稀釋液選擇

稀釋液在精子超低溫冷凍保存過程中能降低抗凍劑毒性，通過調(diào)節(jié)魚類精漿中Na+、Ca2+、K+、Mg2+等離子濃度，從而影響精子細(xì)胞質(zhì)滲透壓、細(xì)胞興奮性和精子的激活［18］。良好的稀釋液可為精子提供合適的生理環(huán)境，延長其在體外存活時(shí)間和防止精子激活［9］。研究發(fā)現(xiàn)，稀釋液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別在美洲鰣魚、黃鱔（Monopterus albus）、蛇鮈（Saurogobio dabryi）的精子超低溫保存中效果較好［9,15,16］；稀釋液Ⅳ對(duì)大銀魚（Protosalanx hyalocranius）［17］和虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［19］精子的超低溫保存效果較好；稀釋液Ⅴ對(duì)大鱗副泥鰍［12］的精子超低溫保存具有一定效果，由于檢測標(biāo)準(zhǔn)不同，故無法對(duì)兩者保存效果進(jìn)行比較。本研究統(tǒng)一檢測標(biāo)準(zhǔn)，比對(duì)不同精液稀釋比，檢測精子活力，結(jié)果顯示，稀釋液Ⅳ用于大鱗副泥鰍精液超低溫冷凍保存，凍精活力較高，可能大鱗副泥鰍與大銀魚和虹鱒的精漿成分和滲透壓較為接近，表明稀釋液Ⅳ可為這些魚類提供合適的生理環(huán)境。

3.2 精子超低溫冷凍保存的抗凍劑選擇

滲透性抗凍劑通過調(diào)節(jié)精子細(xì)胞滲透壓降低精子的冰點(diǎn)，減少冰晶對(duì)精子的損傷起到保護(hù)作用。不同魚類最適抗凍保護(hù)劑的種類不同［20］。GLY和METH作為抗凍劑分別適用于大黃魚（Larimichthys crocea）［21］和河川沙塘鱧（Odontobutis potamophilus）［22］精子的超低溫冷凍保存；DMSO作為抗凍劑在烏克蘭鱗鯉［23］精液的超低溫冷凍保存中效果較好。本研究發(fā)現(xiàn)5%～12.5% DMSO對(duì)大鱗副泥鰍精液冷凍保存的抗凍效果較好，其中10% DMSO保存效果最好，凍精活力可達(dá)54.6（±1.5）%。早期雖有報(bào)道顯示7.5% DMSO用于大鱗副泥鰍精液超低溫冷凍保存，凍精激活率為70%，但凍精活力較低［12］，原因可能是稀釋液和精液的稀釋比例不同。也有學(xué)者認(rèn)為DMSO作為抗凍劑，濃度應(yīng)控制在5%～15%［24］，與本研究結(jié)果相符。可見，DMSO適合于包括大鱗副泥鰍在內(nèi)的多種魚類精液的冷凍保存。

3.3 精子超低溫冷凍保存的精液稀釋比選擇

在精子的超低溫冷凍保存過程中，精液稀釋比例也是影響凍精活力的重要因素。有學(xué)者認(rèn)為，在淡水魚中精液與抗凍液的稀釋比例多在1∶9～1∶3之間［25］；也有研究認(rèn)為，對(duì)于多數(shù)淡水魚類，其精液與稀釋液的最佳稀釋比例在1∶10～1∶2之間［26］。本研究結(jié)果表明，大鱗副泥鰍精液超低溫冷凍保存最適的稀釋比例為1∶3，這與前人研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本研究優(yōu)化了大鱗副泥鰍精液的超低溫冷凍保存技術(shù)，對(duì)5種精液稀釋液進(jìn)行篩選，得到了大鱗副泥鰍精液的最佳稀釋液Ⅳ，稀釋液Ⅳ與3種不同抗凍劑搭配，篩選出效果最佳的抗凍劑為DMSO，并對(duì)其體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳抗凍劑DMSO的最佳體積分?jǐn)?shù)為10% ，進(jìn)一步優(yōu)化精液與最佳稀釋液Ⅳ的體積比為1∶3。研究結(jié)果表明，使用稀釋液Ⅳ為精液稀釋液（精液與稀釋液Ⅳ體積比為1∶3），終濃度10% DMSO為抗凍劑，對(duì)大鱗副泥鰍精液超低溫冷凍保存的效果最佳，超低溫精液冷凍后解凍精子，精子活力可達(dá)65.4（±2.3）%。本試驗(yàn)結(jié)果促使大鱗副泥鰍精液保存技術(shù)得到進(jìn)一步完善，并為生產(chǎn)實(shí)際提供科學(xué)參考。