PEG模擬干旱脅迫對白菜型春油菜芽期生長特性的影響

高 雪，尼瑪扎西，劉國一，譚海運

（省部共建青稞和牦牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室/西藏自治區農牧科學院農業資源與環境研究所，西藏 拉薩 850000）

【研究意義】近年來，水資源供需失衡是世界范圍內農業面臨的最嚴重問題之一，供水不足嚴重制約農業生產。植物對干旱脅迫的響應機制一直是遺傳育種領域的研究熱點。我國油菜種植面積和產量居世界首位［1］，油菜種植區季節性干旱大面積頻發，加之種植區內全年降水量分布不均，對油菜種植過程造成巨大影響。干旱導致油菜無法正常播種、出苗慢、出苗不齊，甚至種植面積減少。【前人研究進展】根系是固定植物及吸收水分、運輸營養物質的重要器官。對根系的研究及調查工作費時費工，而且田間調查取樣容易造成根系結構破壞，這些增加了根系調查的難度。在長期研究及實際工作中，研究者及育種家更多關注植物地上部分對干旱脅迫的應答反應，對根系干旱響應機制研究相對較少［2］。研究發現，干旱脅迫下玉米根重與產量呈正相關，并檢測到與根系相關的16個QTLs位點與干旱脅迫響應有關［3］。不同耐旱性水稻在聚乙二醇6000（PEG6000）溶液處理后，對耐旱性強品種（系）根系特征方面的影響顯著小于抗旱性弱的品種（系）［4］。陳檢鋒等［5］研究認為，玉米根系抗氧化能力的強弱可以區分抗旱級別。干旱脅迫對甘藍型油菜幼苗期根鮮重和側根數具有明顯抑制作用，主根長、側根數可作為甘藍型油菜早期初步抗旱性鑒定的重要輔助指標［2］。不同生理期內，作物的生理反應機制可用于篩選抗旱性品種（系）［6］。相對水分含量、脯氨酸、脅迫指數可作為小麥抗旱性強弱的鑒定指標［7］。一定干旱脅迫程度下，甘藍型油菜葉片中葉綠素、類胡蘿卜素含量隨干旱程度加劇而降低，滲透調節物質、丙二醛含量及抗氧化酶系統活性則隨著干旱程度的加劇而升高［8］。萌發期采用10% PEG6000溶液脅迫處理，顯示抗旱指數、發芽率、根長、苗高和根體積等指標可作為甘藍型油菜早期初步篩選抗旱性材料的鑒定指標［9］。【本研究切入點】西藏地區春油菜播種期干旱少雨，選育、篩選出抗旱性白菜型春油菜品種（系）能很好解決播種期干旱少雨的情況［10］。采用PEG6000溶液模擬干旱脅迫研究白菜型春油菜抗旱性的方法，重復性好、周期短、實驗條件易于控制，可快速篩選抗旱性白菜型春油菜品種（系）。【擬解決的關鍵問題】本研究采用不同濃度PEG6000溶液模擬干旱脅迫，探索白菜型春油菜幼苗對干旱脅迫的響應機制，篩選適宜的PEG6000濃度及抗旱性白菜型春油菜品種（系），為西藏白菜型春油菜抗旱性育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

124220-1、藏油3號、104005、093431等4個品種（系）白菜型春油菜種子由西藏自治區農牧科學院資源與環境研究所提供。

1.2 試驗方法

干旱脅迫參考米超等［11］方法進行，發芽試驗參考GB/T3543.4-1995。為保證試驗一致性，分別隨機選取各品種（系）白菜型春油菜種子1 000粒，先用5% NaClO溶液消毒5 min，再用蒸餾水沖洗干凈，以三層濾紙為芽床，置于25℃自然光下萌發，5 mL蒸餾水保濕。待種子露白，選取100粒正常發芽的種子轉至PEG6000溶液為培養液（濃度分別為0%、5%、10%、15%、20%、25%）的培養皿（直徑12 cm，芽床由五層吸水紙及一層濾紙構成）繼續培養，進行模擬干旱脅迫處理，以培養液為蒸餾水為對照，每個培養皿為1個重復，共3個重復。培養箱設置條件：晝/夜溫度25℃/18℃，時長14h/10 h，光照條件為4 000 lx，脅迫處理時間為7 d。脅迫處理結束后統計白菜型春油菜幼苗存活數，計算成苗率；隨機選取20株測定幼苗苗高、主根長、單株鮮重等形態指標，并計算相對活力指數、傷害率：

相對活力指數=處理成苗率×處理幼苗苗高；

取整株材料測定丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、可溶性蛋白（SPr）含量及超氧化物酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性，測定方法參照文獻［12］，3次重復。

試驗數據采用Excel 2016進行統計分析，采用 SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 白菜型春油菜芽期幼苗形態指標對PEG脅迫的響應

不同濃度PEG6000溶液模擬干旱脅迫后各品種（系）白菜型春油菜的成苗率見表1。由表1可知，124220-1成苗率由96.02%下降至32.37%，傷害率由10.82%增加至66.29%；藏油3號成苗率由93.33%下降至32.33%，傷害率由7.56%增加至65.36%；104005成苗率由92.67%下降至32.37%，傷害率由7.92%增加至61.88%；093431成苗率由95.33%下降至25.58%，傷害率由16.33%增加至73.16%。隨干旱脅迫加劇，白菜型春油菜成苗率呈下降趨勢，傷害率呈增長趨勢，其中124220-1在每個處理梯度的傷害率均略大于其他品種，而104005均略低于其他3個品種。

從表1、表2可以看出，不同濃度PEG6000溶液脅迫后，各品種（系）白菜型春油菜平均苗高124220-1由45.33%降至14.98%，其中，藏油3號由29.43%降至10.11%，104005由31.39%降至9.02%，093431由27.57%降至11.26%；主根長124220-1由23.98%降至8.67%，藏油3號由25.3%降至11.23%，104005由19.33%降至10.62%，093431由24.33%降至12.58%；單株鮮重124220-1由60.25%降至25.25%，藏油3號由50.41%降至28.81%，104005由43.89%降至23.84%，093431由51.18%降至34.89%；相對活力指數124220-1由0.70降至0.11，藏油3號由0.70降至0.12，104005由0.73降至0.13，093431由0.69降至0.10。平均苗高、單株鮮重、主根長、相對活力指數均隨PEG6000溶液濃度增加而下降，幼苗各指標（平均苗高、單株鮮重、主根長）傷害率亦同時增加。4個品種（系）白菜型春油菜各生長特性指標傷害率大小不同，其中，124220-1各指標略大于其他3個品種（系），為104005＞093431＞藏油3號＞124220-1，抗旱性相對強弱排序亦如此。

以相對活力指數作為作物抗旱性鑒定指標已用于實際工作［11-12］，在15% PEG6000溶液濃度時，各品種（系）白菜型春油菜相對活力指數在50%～60%之間，成苗率分別為69.67%、68.67%、66.33%、59.67%，20%濃度成苗率分別為32.37%、32.33%、35.33%、25.58%。可將15%～20%濃度范圍作為白菜型春油菜模擬干旱脅迫的適宜濃度，對應滲透壓約為-0.4MPa［13］。

2.2 白菜型春油菜芽期幼苗抗氧化酶活性對PEG脅迫的響應

從圖1可以看出，隨PEG6000溶液濃度升高，在5%～15%濃度范圍內，4種白菜型春油菜SOD、POD、CAT活性均呈升高趨勢。各溶液濃度脅迫下的白菜型春油菜SOD活性均大于對照，差異顯著。溶液濃度為15%～20%時，SOD活性不再升高，達到最大；濃度高于20%時，SOD活性呈下降趨勢，差異達到顯著性水平（圖1A）。104005在各溶液濃度脅迫下的SOD活性均高于其他3個品種（系），可見104005的抗旱性較強于其他3個品種（系）。不同PEG6000溶液濃度處理對白菜型春油菜的POD、CAT活性變化較大，均達到顯著性水平（圖1B、C），變化趨勢與SOD變化趨勢相似，且在一定溶液濃度范圍內，白菜型春油菜抗氧化系統酶活性變化與濃度呈正相關關系，可以區別不同品種（系）抗旱性強弱。

2.3 白菜型春油菜膜滲透性及膜損傷對PEG脅迫的響應

2.3.1 滲透調節物質對PEG脅迫的響應 隨著PEG6000溶液濃度升高，4個品種（系）白菜型春油菜SPr含量變化均較大（圖2A），差異顯著。在0%～15%濃度范圍內，SPr含量隨濃度升高而增加，油菜細胞通過SPr含量升高調整滲透勢促進吸水，維持細胞正常狀態。在20%濃度時SPr含量達到峰值，超過20%時，含量下降，差異達到顯著性水平，此時已超過白菜型春油菜細胞抵御干旱的耐受程度。其中，104005變化程度明顯高于其他3個品種（系），最大變化值為60 mg/g；124220-1變化相對最小、最大變化值為50 mg/g。

表1 PEG6000溶液處理對白菜型春油菜幼苗成苗率、苗高及相對活力指數的影響Table 1 Effects of PEG6000 solution treatments on seedling survival rate, seedling height and relative vigor index of spring rapeseed（B. campestris L.）

不同PEG6000溶液濃度（0%～20%）下，4個品種（系）白菜型春油菜Pro含量明顯升高（圖2B），達到顯著性水平。20%濃度時4個品種白菜型春油菜Pro含量變化最明顯，變化值最大，達到峰值；當溶液濃度高于25%時，Pro含量下降明顯，達到顯著性水平，該干旱脅迫程度超過白菜型春油菜幼苗承受能力，使細胞內環境穩態破壞。其中，104005在各濃度處理中上升幅度最明顯，最大變化值達到50 μg/g。

隨著PEG6000溶液濃度升高，4個品種（系）白菜型春油菜SS含量呈上升趨勢，與濃度呈正相關關系，變化達到顯著性水平（圖2C）。同時細胞內滲透勢調節物質含量增加并積累，其中，104005在各濃度處理上變化最大，SS含量呈上升趨勢，最大變化值達到45 μg/g；124220-1變化趨勢與104005變化趨勢相似，變化值相對最小，最大變化值為36 μg/g。20%濃度處理時，不同品種（系）白菜型春油菜SS含量差異顯著，此濃度可作為白菜型春油菜抗旱性研究適宜的濃度水平，應用于實際工作。

表2 PEG6000溶液處理對白菜型春油菜幼苗主根長及單株鮮重的影響Table 2 Effects of PEG6000 solution treatments on seedling main root length and fresh weight per plant of spring rapeseed（B. campestris L.）

圖1 PEG6000溶液處理對白菜型春油菜抗氧化酶活性的影響Fig. 1 Effects of PEG6000 solution treatments on antioxidant enzyme activity of spring rapeseed（B. campestris L.）

2.3.2 MDA對PEG脅迫的響應 MDA是細胞質膜過氧化產物，植物細胞遭受逆境脅迫時，其含量可反映膜系統過氧化損傷的程度。4個品種（系）白菜型春油菜MDA含量均隨PEG6000溶液濃度上升呈上升趨勢（圖2D），呈正相關關系，達到顯著性水平。124220-1在各濃度處理上變化最大，相較其他3個品種（系）對PEG6000溶液更敏感，而104005相對較遲鈍，變化值小于其他3個品種（系）。

3 討論

遭受干旱脅迫時，作物根系首先作出響應，進而影響作物的生長發育及形態建成［13］，產量亦受到影響。根系是作物吸收水分、運輸養分及物質合成、同化、轉化的主要器官［4］，研究作物根系與抗旱性的關系具有重要意義。作物遺傳育種領域以種子早期萌發指標篩選抗旱材料的方法已得到廣泛應用［14-18］，根系的深度、根粗、根長、側根數等指標與植物抗旱性強弱具有相關性，根系越發達，植物抗旱性越強。本研究以PEG6000溶液模擬干旱脅迫，研究4個品種（系）白菜型春油菜芽期幼苗形態特征及生理生化的變化，結果表明，苗高、主根長、單株鮮重、相對活力指數等早期指標隨PEG脅迫程度增強而加劇，其中強抗旱性品種（系）各指標下降程度均小于抗旱性弱品種（系）。相對活力指數、苗高等指標可作為衡量抗旱性強弱的重要指標，其他指標可作為抗旱性篩選的輔助指標［19］，篩選出品系104005抗旱性強于其他3個品種（系）。

干旱脅迫時，細胞內抗氧化酶系統最先反應，清除細胞內由于干旱產生的大量過氧化自由基。植物體內的活性氧自由基具有雙重性作用［20］。植物遭受外界干旱、寒冷等逆境脅迫時，細胞抗氧化酶系統最先反應，能清除細胞內由于外界脅迫產生的活性氧自由基，保護細胞免受活性氧自由基的氧化損傷，細胞內產生的活性氧自由基同時也是信號轉導的信號物質，同時在脅迫信號傳遞過程中發揮重要作用，使植物對逆境脅迫做出響應。逆境脅迫下，在植物細胞耐受范圍內，細胞內產生的活性氧自由基可被抗氧化酶系統清除，超出這一范圍即細胞內氧自由基積累到一定程度，抗氧化酶系統不能完全清除細胞內過量的自由基，即會造成細胞氧化損傷，此時過量活性氧自由基亦可作為信號傳導物質誘發植物體內產生與抗旱相關蛋白質及相關基因表達，以抵御干旱逆境［21-23］。SPr、SS、Pro是植物體內適應干旱、寒冷、高溫、鹽漬等逆境脅迫過程中重要的滲透調節物質，通過增加和積累含量提高細胞保水能力，對細胞的生命物質及生物膜起保護作用，使其能在外界處于干旱逆境中繼續吸水，以維持植物體細胞的正常形態及正常生長發育，增加植物干旱耐受力。細胞質膜系統穩定性是植物細胞正常生長發育的基礎，逆境脅迫中植物細胞膜系統穩定性（通透性及流動性）是植物抵御逆境能力的體現。干旱、低溫等逆境脅迫破壞細胞質膜的分子結構及功能，使植物細胞內外物質交換發生改變，其中細胞內物質外滲、胞外物質自由進出細胞是細胞膜系統破壞的表現，植物生長發育受到逆境影響。植物細胞內產生的氧自由基主要攻擊膜系統，膜系統損傷的主要產物是MDA。研究發現，可以通過測定細胞MDA含量評價植物抵御逆境的能力［24］。本研究結果表明，隨著PEG脅迫濃度提高，MDA含量升高，細胞質膜過氧化增強，其中104005升高的程度最低，抗逆性強于其他3個品種（系）。

圖2 PEG6000溶液處理對白菜型春油菜滲透調節物質及MDA含量變化Fig. 2 Effects of PEG6000 solution treatments on seedling osmoregulation and MDA content of spring rapeseed（B. campestris L.）

4 結論

本研究以不同濃度PEG6000溶液模擬干旱脅迫，研究其對4個品種（系）白菜型春油菜芽期根系特征的影響，發現成苗率、主根長、苗高、單株鮮重隨溶液濃度升高逐漸下降，相對活力指數亦下降，其中，苗高及相對活力指數變異最大，各品種（系）變異系數均大于31%。抗氧化酶活性隨溶液濃度呈先升高后降低趨勢，在15%濃度時活性最高，高于此濃度活性下降；SS、MDA含量隨PEG6000溶液濃度升高而增加，滲透調節物質（SPr、Pro）呈先升后降趨勢。綜合相對活力指數及生理生化指標可知，15%～20% PEG6000溶液濃度時，各品種（系）白菜型春油菜相對活力指數在50%～60%之間，也是抗氧化酶活性及滲透調節物質含量變化的轉折點，可作為模擬水分脅迫抗旱性研究的最適濃度，并篩選到抗旱性白菜型春油菜品系104005。