川續斷皂苷Ⅵ經ATF6通路對H9c2心肌細胞氧化應激和凋亡的保護作用

馮海斌，張巍，李琴，柴巧英，韓繼如，李娟

氧化應激(OS)是促進細胞凋亡的重要因素，并涉及多種心血管疾病的病理生理，如缺血/再灌注損傷、動脈粥樣硬化、心力衰竭和高血壓[1-2]。OS表現為活性氧(ROS)的過度產生，后者破壞細胞的氧化還原平衡和內質網蛋白質折疊環境的穩態，最終導致細胞死亡和器官功能障礙等一系列事件[3]。要恢復內質網穩態，細胞會激活未折疊的蛋白質反應(UPR)信號通路，這些通路由活化轉錄因子6(ATF6)、肌醇需求激酶1α(IRE1α)和蛋白激酶樣內質網激酶(PERK)調節[4]。因此，每個UPR通路的差異調節可能是治療心血管疾病的一種治療策略。研究表明，ATF6的激活可增加內質網駐留蛋白的表達，從而避免錯誤折疊的蛋白，包括葡萄糖調節蛋白78(GRP78)、GRP94和蛋白二硫化物異構酶A6(PDIA6)[5]。此外，ATF6的激活還誘導抗OS基因[6]。這些研究表明，ATF6對OS具有重要的保護功能。川續斷皂苷Ⅵ是川續斷的主要活性成分，具有抗氧化和抗炎等生物學效應，可以保護新生大鼠心肌細胞免受過氧化氫(H2O2)誘導的損傷，但其機制尚不清楚[7]。因此，本研究探討川續斷皂苷Ⅵ對H9c2心肌細胞氧化應激和凋亡的保護作用及機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細胞： H9c2心肌細胞(上海生命科學研究院細胞庫)。(2)試藥試劑：川續斷皂苷Ⅵ(四川省維克奇生物科技有限公司，純度 99.9%)；30% H2O2(江蘇凱基生物技術股份有限公司)，胎牛血清和RPMI-1640培養基(美國Invitrogen公司)，細胞計數試劑盒8 (CCK-8,美國Amresco公司)；2' 7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)、 乳酸脫氫酶(LDH)和丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；ECL試劑盒、細胞凋亡檢測AnnexinV/PI試劑盒和細胞蛋白抽提試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；聚偏氟乙烯膜(碧云天生物技術研究所)；B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl關聯性X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)、ATF6、GRP78、PDIA6和GAPDH抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶HRP標記親和純化山羊抗小鼠IgG抗體(武漢艾美捷科技有限公司)。(3)儀器：EliteⅡ型CO2培養箱(美國Thermo Revco公司)，S-450D型超聲波細胞破碎儀(美國BRANSON公司)，HBS-1096B型酶標儀(南京德鐵實驗設備有限公司)，DYCZ-28型BD垂直電泳儀和BD FACSCanto型流式細胞儀(美國BD公司)；BioSpectrum型凝膠成像儀(美國UVP公司)。

1.2 細胞培養及實驗分組 2019年6—9月于邯鄲市第一醫院實驗室進行實驗。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液在37℃、5% CO2下培養H9c2細胞，當細胞融合率達到80%時進行實驗。實驗分為對照組、H2O2組及川續斷皂苷Ⅵ低、中、高劑量組。對照組加入無血清RPMI-1640培養基，H2O2組加入終濃度為200 μmol/L的H2O2，川續斷皂苷Ⅵ低、中、高劑量組加入終濃度為25、50、100 μmol/L的川續斷皂苷Ⅵ，同時給予終濃度為200 μmol/L的H2O2，繼續培養24 h后進行相關檢測[8-9]。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 CCK-8 法檢測H9c2細胞增殖率：將H9c2細胞以5×103個/孔接種于96孔板中(200 μl /孔)，待細胞融合后，按上述實驗方法給予川續斷皂苷Ⅵ和H2O2進行干預20 h，向培養板中加入 CCK-8試劑10 μl，37℃繼續培養4 h，用酶標儀在630 nm處測定吸光度值(OD值)，計算細胞增殖率(細胞增殖率=實驗組OD值/對照組OD值)。

1.3.2 H9c2細胞凋亡率檢測：將H9c2細胞以5×104個/孔接種于6孔板內(3 ml/孔)，待細胞融合后，按上述實驗方法給予川續斷皂苷Ⅵ和H2O2進行干預24 h，根據細胞凋亡檢測AnnexinV/PI試劑盒說明書檢測細胞凋亡。

1.3.3 H9c2細胞內ROS、LDH和MDA的測定：將H9c2細胞以5×104個/孔接種于6孔板內(3 ml/孔)，待細胞貼壁后，按上述實驗方法給予川續斷皂苷Ⅵ和H2O2進行干預24 h，棄培養基，采用DCFH-DA探針聯合酶標儀法檢測細胞內ROS水平；接種孔內加入磷酸鹽緩沖液2 ml，用超聲波細胞破碎儀處理30 s，離心收集上清液，按試劑盒說明書檢測細胞中LDH、MDA水平。

1.3.4 H9c2細胞內Bcl-2、Bax、Caspase-3、ATF6、GRP78和PDIA6水平檢測：采用Western-blot法檢測。將H9c2細胞以5×104個/孔接種于6孔板內(3 ml/孔)，待細胞貼壁后，按上述實驗方法干預24 h，棄培養基，根據細胞量加入細胞蛋白抽提液，裂解2 h；離心取上清進行蛋白定量；調整蛋白濃度，加入1/5體積的5×Buffer，沸水進行變性，進行電泳(每孔上樣量為20 μg)，將印跡轉移到聚偏氟乙烯膜上，然后用5%脫脂牛奶在室溫下封膜1 h，將膜與Bcl-2(1∶200)、Bax(1∶400)、Caspase-3(1∶300)、ATF6(1∶500)、GRP78(1∶200)、PDIA6(1∶500)和GAPDH(1∶5 000)抗體進行孵育，4℃過夜，用TBST緩沖液對膜進行2次沖洗，將膜與辣根過氧化物酶HRP標記山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)在室溫下孵育30 min。進行顯色，采集圖像進行分析。采用ECL染液進行顯色，然后用BioSpectrum型凝膠成像儀定量分析蛋白表達強度，以GAPDH表達作為內控。

2 結 果

2.1 各組H9c2細胞增殖和凋亡比較 與對照組比較，H2O2組H9c2細胞增殖率降低，凋亡率升高，差異均有統計學意義(P<0.01)；與H2O2組比較，各川續斷皂苷Ⅵ組H9c2細胞增殖率升高，凋亡率降低，且呈劑量依賴性，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組H9c2細胞增殖和凋亡情況比較

2.2 各組H9c2細胞內ROS、LDH和MDA水平比較 與對照組比較，H2O2組H9c2細胞內ROS、LDH和MDA水平均升高(P<0.01)；與H2O2組比較，各川續斷皂苷Ⅵ組H9c2細胞內ROS、LDH和MDA水平均降低，且呈劑量依賴性，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2、圖1。

表2 各組H9c2細胞內ROS、LDH和MDA水平比較

2.3 各組H9c2細胞內Bcl-2、Bax和Caspase-3水平比較 與對照組比較，H2O2組H9c2細胞內Bcl-2水平降低，Bax和Caspase-3水平升高，差異均有統計學意義(P<0.01)；與H2O2組比較，各川續斷皂苷Ⅵ組H9c2細胞內Bcl-2水平增加，Bax和Caspase-3水平降低，且呈劑量依賴性，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3、圖2。

表3 各組H9c2細胞內Bcl-2、Bax和Caspase-3水平比較

2.4 各組H9c2細胞內ATF6、GRP78和PDIA6水平比較 與對照組比較，H2O2組H9c2細胞內ATF6、GRP78和PDIA6水平均降低(P<0.01)；與H2O2組比較，各川續斷皂苷Ⅵ組H9c2細胞內ATF6、GRP78和PDIA6水平增加，且呈劑量依賴性，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表4、圖3。

表4 各組H9c2細胞內ATF6、GRP78和PDIA6水平比較

3 討 論

研究表明，川續斷皂苷Ⅵ通過限制腦缺血/再灌注損傷，增加微血管數量并改善腦缺血后的血流發揮神經保護作用[10]。川續斷皂苷Ⅵ還可減輕H2O2誘導的PC12細胞凋亡和ROS水平的增加，并增強局灶性腦缺血大鼠皮質組織中抗氧化酶的活性[11]。然而，川續斷皂苷Ⅵ對心肌細胞氧化損傷的作用及其機制尚不清楚。H9c2是源自BD1X大鼠心室的克隆細胞系，具有許多心肌的電生理、離子通道和受體等特性[12]。H2O2誘導的H9c2細胞模型已被廣泛用于確定心臟氧化損傷的發病機制及其治療策略[13]。本研究單獨用H2O2處理可以顯著增加H9c2細胞中ROS、LDH和MDA水平，用川續斷皂苷Ⅵ處理后能減弱H2O2對H9c2細胞的損傷，表明川續斷皂苷Ⅵ具有抗氧化作用。

ROS直接破壞細胞結構、核酸、脂質和蛋白質，并引發一系列事件，加劇細胞損傷，參與了與炎性反應、代謝和凋亡相關的細胞內信號級聯。研究發現，ROS的過度生成會影響內質網的穩態，干擾蛋白質的正確折疊，最終啟動內質網應激介導的凋亡通路，加重心肌細胞損傷[14]。在嚴重內質網應激條件下，促凋亡的轉錄因子CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CHOP)被強烈誘導。CHOP的激活改變了凋亡相關蛋白，如Bax和Bcl-2[15]。Bcl-2和Bax基因在決定細胞凋亡后的存活或死亡中起主要作用。Caspase-12是內質網應激誘導凋亡的另一種主要凋亡相關蛋白，其激活間接激活了胞質Caspase-3，Caspase-3是誘導細胞死亡的主要效應蛋白酶[16]。本研究中川續斷皂苷Ⅵ處理抑制了H2O2的作用，降低了細胞凋亡率、Bax和Caspase-3水平，增加了細胞增殖率、Bcl-2水平，表明川續斷皂苷Ⅵ對H2O2誘導損傷的保護作用涉及抑制內質網應激介導的細胞凋亡，和上述文獻研究一致。

內質網應激最初會觸發一個適應性UPR過程以恢復內質網穩態，如果內質網應激未能解決，則UPR會抑制適應性反應并觸發細胞凋亡。3種ER跨膜蛋白，即ATF6、IRE1a和PERK，通過靶向不同的基因來動員UPR。研究發現，銀杏內酯K通過激活IRE1a信號來保護心臟免受衣霉素誘導的內質網應激[17]；PERK激活在β-淀粉樣蛋白誘導的內質網應激下恢復細胞內環境平衡中起重要作用[18]。與IRE1a和PERK相反，在心肌缺血/再灌注期間，UPR的ATF6通路在響應ROS介導的內質網應激中起主要作用[19]。在體內和離體模型及培養的心肌細胞中，ATF6表達上調對缺血/再灌注損傷具有保護作用。使用轉基因小鼠模型的研究表明，激活ATF6可保護心臟免受缺血/再灌注損傷[20]。ATF6激活會結合內質網應激反應元件，導致ATF6誘導的內質網蛋白(如GRP78、GRP94和PDIA6)的表達增加[21]。預先誘導的GRP78保護心肌細胞免于OS誘導的細胞死亡，并且H9c2細胞中GRP94過表達減少了應激誘導的細胞死亡；PDIA6通過增強內質網蛋白折疊，保護心肌細胞免受缺血/再灌注誘導的細胞死亡[22-23]。此外，對小鼠心臟中ATF6基因缺失的研究表明，內源性ATF6對缺血/再灌注損傷具有重要的保護作用，因為它是誘導多種抗氧化劑蛋白[如過氧化氫酶(Catalase，CAT)]所必需的。CAT中和了ATF6中大量的ROS，通過將H2O2轉化為O2和水，從而減輕OS損傷[24]。本研究結果顯示，川續斷皂苷Ⅵ處理激活了H2O2處理的H9c2細胞中ATF6及其下游基因GRP78和PDIA6水平升高，表明川續斷皂苷Ⅵ通過ATF6通路發揮心肌細胞保護作用。

綜上所述，川續斷皂苷Ⅵ通過激活ATF6通路，減輕H2O2誘導的H9c2細胞氧化應激和抑制細胞凋亡，從而發揮心肌保護作用，為川續斷皂苷Ⅵ治療心肌損傷的開發提供理論基礎。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

馮海斌：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；張巍：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；李琴：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；柴巧英：進行統計學分析；韓繼如、李娟：課題設計，論文撰寫