石斛合劑序貫法對db/db糖尿病小鼠血清LPS、IL-6、IL-10及糖代謝的影響

林曉暉 張捷平 陳 勇 鄭燕芳 施 紅

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建福州 350122）

隨著城市化、老齡化以及生活方式的改變等，2 型糖尿病（T2DM）患病率逐年增高，已經(jīng)發(fā)展成為我國常見的內(nèi)分泌代謝性疾病[1]。T2DM 后期并發(fā)癥致殘、致死率高，消耗巨大的醫(yī)療資源，給患者和社會造成了極大負(fù)擔(dān)。越來越多研究表明[2]，由炎癥因子介導(dǎo)的慢性低度炎癥引發(fā)胰島素抵抗，是T2DM 發(fā)病的重要原因，但其機(jī)制復(fù)雜。其中腸道菌群失調(diào)、腸道屏障功能受損，導(dǎo)致循環(huán)系統(tǒng)中來自于革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的脂多糖（LPS）水平升高，從而激活Toll 樣受4（TLR4）信號通路，使血漿和組織促炎因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）等水平增加，是導(dǎo)致慢性低度炎癥及誘發(fā)胰島素抵抗的重要機(jī)制之一[3]。前期研究表明，以石斛合劑基本方（現(xiàn)為福建省第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑）為基礎(chǔ)，依從滋陰清熱、益氣活血、清肝泄?jié)岱ǖ氖蟿┬蜇灧ǎ谥委烼2DM 及其并發(fā)癥，糾正T2DM 的糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗等方面具有很好的療效[4-5]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究石斛合劑序貫療法對糖尿病小鼠血清中LPS 水平、相關(guān)炎癥指標(biāo)及整體水平糖代謝的影響，從而分析其治療糖尿病的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

db/db 小鼠18 只，平均體質(zhì)量（44.6±3.5）g，db/m 小鼠6 只，平均體質(zhì)量（23.6±1.5）g，均為12 ～ 13 周齡的無特定病原體動物（Specific pathogen Free，SPF）級雄性小鼠，由北京大學(xué)（醫(yī)學(xué)部）實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部提供，許可證號：SCXK（京）2011-0012，于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF 級環(huán)境中飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)期間，喂以普通飼料，自由飲水，環(huán)境溫度20 ～ 23 ℃，相對濕度 55% ～70%，12 h 光照，晝夜循環(huán)。

1.2 藥物、試劑及儀器

石斛合劑1 號方（石斛15 g，黃芪20 g，五味子8 g，丹參20 g，葛根15 g，生地黃18 g，玄參10 g，知母12 g），石斛合劑2 號方（茵陳18 g，大黃3 g，梔子10 g，柴胡6 g，萹蓄15 g，甘草6 g），購自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院。采用常規(guī)水煎2 次后合并，過濾濃縮成含藥量1.2 g/mL 的藥液。二甲雙胍緩釋片配制濃度為20 mg/mL。

小鼠胰島素（Ins）ELISA 試劑盒（YX-061899R）、小鼠脂多糖（LPS）ELISA 試劑盒（YX-064351R）、小鼠白介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒（YX-039315R）、小鼠白介素-10（IL-10）ELISA 試劑盒（YX-033912R）均購自北京議達(dá)成科技有限公司；糖化血清蛋白（GSP）測定試劑盒（果糖胺法，A037-1，20180718）購自南京建成生物技術(shù)公司；ELx800 型酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek 公司。

1.3 方法

1.3.1 分組及給藥

db/db 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，選取空腹血糖（FBG）≥11.1 mmoL/L 為糖尿病模型鼠，按FBG 和體質(zhì)量隨機(jī)分成三組：分別為模型組、石斛合劑序貫組（以下簡稱序貫組）和二甲雙胍組，每組6 只。再取6 只同周齡表型正常的db/m 小鼠為正常對照組（以下簡稱正常組）。以上4 組小鼠灌胃給藥，1次/d。其中，序貫組給予1號方12 g/（kg·d）連續(xù)4 d，再續(xù)以2 號方12 g/（kg·d）連續(xù)3 d 為1 個療程，每個療程之間停藥1 d，連續(xù)給藥8 個療程（64 d）；二甲雙胍組給予二甲雙胍0.2 g/（kg·d）；正常組和模型組給予生理鹽水10 mL/（kg·d）。各組小鼠每周稱重1 次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整藥液的灌胃體積。

1.3.2 血清學(xué)指標(biāo)測定

分別在干預(yù)前及干預(yù)后2、4、6、8 個療程，禁食不禁水10 h，采用割尾法取血，血糖儀檢測各組小鼠的空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）；干預(yù)8 個療程（64 d）后，摘眼球取血，分離收集各組小鼠的空腹血清，采用果糖胺法測定血清GSP 含量，采用ELISA 法測定血清胰島素（fasting serum insulin，F(xiàn)INS）、脂多糖（LPS）、白介素-6（IL-6）和白介素-10（IL-10）的含量。計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR，計(jì)算公式：HOMA-IR=FBG（mmoL/L）×FINS（mU/L）/22.5[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以[例（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)前后各組小鼠FBG 的比較

干預(yù)前模型組、序貫組與二甲雙胍組的FBG 均顯著高于正常組（P ＜0.01），但模型組、序貫組二甲雙胍組三組FBG 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。從干預(yù)4 個療程開始，序貫組與二甲雙胍組的FBG 較模型組顯著下降（P ＜0.05），二甲雙胍組的FBG 與干預(yù)前比較也顯著下降（P ＜0.05）。

干預(yù)8 個療程后，序貫組與二甲雙胍組的FBG 均比模型組顯著下降（P ＜0.01），序貫組與二甲雙胍組的FBG與干預(yù)前比較均顯著下降（P ＜0.05），見表1。

表1 石斛合劑序貫法對db/db 小鼠FBG 的影響（±s，mmol/L）

表1 石斛合劑序貫法對db/db 小鼠FBG 的影響（±s，mmol/L）

注：與正常組比較，*P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，▲P ＜0.01；與本組干預(yù)前比較，●P ＜0.05，★P ＜0.01。

組別 n 干預(yù)前 2個療程 4個療程 6個療程 8個療程正常組 6 5.85±0.67 5.95±0.75 5.72±0.78 6.00±0.70 6.05±0.74模型組 6 18.78±3.05* 18.95±2.60* 20.30±2.29* 21.05±1.91* 22.42±2.16*序貫組 6 19.03±3.62* 18.45±1.98* 17.25±1.91*# 16.87±3.43*# 15.80±2.14*▲●二甲雙胍組 6 18.97±3.06* 17.67±3.73* 15.75±2.97*▲● 13.88±2.52*▲★ 13.32±2.46*▲★

2.2 各組小鼠GSP、FINS 與HOMA-IR 的比較

干預(yù)8 個療程后，模型組血清GSP、FINS 和HOMAIR 均顯著高于正常組（P ＜0.01），表明db/db 小鼠長期處于高血糖、高胰島素血癥及高胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。與模型組相比，序貫組和二甲雙胍組血清GSP（P ＜0.01）、FINS（P ＜0.01）及HOMA-IR（P ＜0.01）均顯著降低。序貫組和二甲雙胍組在干預(yù)結(jié)束后GSP 含量與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見表2。

2.3 各組小鼠血清LPS、IL-6 和IL-10 的比較

干預(yù)8 個療程后，模型組的LPS、IL-6 均高于正常組（P ＜0.01），IL-10 低于正常組表明db/db 小鼠處于內(nèi)毒素血癥及慢性炎癥狀態(tài)。與模型組相比，序貫組和二甲雙胍組血清LPS 水平均顯著降低兩組血清LPS 水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；序貫組和二甲雙胍組血清IL-6 水平與模型組比較均顯著降低（P ＜0.01），但序貫組和二甲雙胍組血清IL-6 水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）；序貫組和二甲雙胍組均顯著升高血清IL-10水平與模型組比較（P ＜0.01），膽序貫組和二甲雙胍組血清IL-10 水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見表3。

表2 石斛合劑序貫法對db/db 小鼠GSP、FINS 和HOMA-IR 的影響（±s）

表2 石斛合劑序貫法對db/db 小鼠GSP、FINS 和HOMA-IR 的影響（±s）

注：與正常組比較，*P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.01。

組別 n GSP（mmol/L） FINS（mU/L） HOMA-IR正常組 6 3.83±0.24 22.24±4.59 6.05±1.46模型組 6 5.30±0.40* 62.62±4.53* 62.52±9.52*序貫組 6 4.03±0.69# 43.76±2.45*# 31.34±5.97*#二甲雙胍組 6 3.95±0.30# 37.01±2.77*# 22.91±4.25*#

表3 石斛合劑序貫法對db/db 小鼠LPS、IL-6 和IL-10 的影響（±s）

表3 石斛合劑序貫法對db/db 小鼠LPS、IL-6 和IL-10 的影響（±s）

注：與正常組比較，*P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.01；與序貫組比較，▲P ＜0.01。

組別 n LPS（EU/L） IL-6（pg/mL） IL-10（pg/mL）正常組 6 566.43±39.88 127.43±10.31 561.89±71.73模型組 6 981.48±93.40* 294.35±17.58* 171.19±39.04*序貫組 6 762.88±45.46*# 241.40±14.53*# 498.38±61.74#二甲雙胍組 6 665.08±45.71*#▲238.94±10.75*# 534.49±62.35#

3 討論

T2DM 作為糖尿病的主要類型，患者以高血糖為顯著特征，常伴隨著肥胖和胰島素抵抗。糖尿病在中醫(yī)學(xué)中屬于“消渴”的范疇，主要由飲食不節(jié)、情志不調(diào)、先天稟賦不足等各種因素引起，任其發(fā)展，多表現(xiàn)為氣陰兩虛，夾雜痰濁、濕熱、瘀血阻于脈絡(luò)。本研究采用的是施紅教授 “滋陰益氣、活血泄?jié)帷钡氖蟿┬蜇灧āＪ蟿┬蜇灧街校? 號方滋陰清熱、益氣活血，2 號方清肝利濕泄?jié)帷煞揭佬蚍磸?fù)交替、循環(huán)治療，稱為石斛合劑序貫法[6-8]。前期研究表明，石斛合劑序貫法在臨床上可以明顯改善T2DM 患者燥熱、煩渴、盜汗等癥狀，顯著降低血糖、調(diào)節(jié)血脂等。基礎(chǔ)研究中，石斛合劑及其序貫法亦能保護(hù)糖尿病模型鼠的胰腺組織、糾正糖脂代謝異常癥狀、抗氧化及降低炎癥蛋白表達(dá)和釋放等，并能延緩糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[9]。

本研究選用的糖尿病模型鼠db/db 小鼠是從瘦素受體基因缺陷的C57BL / Ks 小鼠中篩選而來的突變系，表現(xiàn)為肥胖、高血糖、高胰島素血癥等代謝異常，常并發(fā)糖尿病微血管病變，是研究人類T2DM 理想的動物模型。由于db/db小鼠的瘦素受體基因缺陷，瘦素信號通路障礙，進(jìn)而影響其對胰島素分泌的抑制作用，胰腺β 細(xì)胞持續(xù)分泌胰島素，引發(fā)高胰島素血癥。通過糖代謝相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)的檢測表明，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與以往研究報(bào)道一致[10]，db/db小鼠與對照組db/m 小鼠相比，表現(xiàn)出高血糖、高胰島素及胰島素抵抗等癥狀。通過石斛合劑序貫法進(jìn)行干預(yù)治療后，db/db 小鼠的空腹血糖（FBG）逐漸下降，從第4 個療程開始，與模型組有顯著差異；治療8 個療程后，序貫組的FBG 與模型組的差異更加明顯，但與二甲雙胍組無顯著差異。經(jīng)過8 個療程的干預(yù)，序貫組的血清空腹胰島素水平以及胰島素抵抗指數(shù)均比模型組有顯著降低，表明胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)得到緩解。

糖化血清蛋白（GSP）是血清中的葡萄糖與血清蛋白之間形成的高分子酮胺化合物。由于血清蛋白半衰期較血紅蛋白短，該指標(biāo)可以反映檢測前3 周內(nèi)平均血糖水平，且不受臨時血糖波動的影響，可用于觀測近期血糖控制的情況[11]。本研究中，模型組GSP 顯著高于正常組，表明db/db 小鼠存在持續(xù)性高血糖的狀態(tài)，而序貫組經(jīng)過8個療程的干預(yù)治療，GSP 含量比模型組顯著降低，但與正常組及二甲雙胍組無顯著差異。該結(jié)果表明，石斛合劑序貫法對穩(wěn)定平均血糖水平發(fā)揮重要作用，干預(yù)后db/db 小鼠血糖控制良好。

T2DM病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。越來越多的研究表明[12]，由炎癥因子介導(dǎo)的慢性低度炎癥是糖尿病的發(fā)病及持續(xù)進(jìn)展的重要原因。其中腸道微環(huán)境的改變與慢性低度炎癥密切相關(guān)，由于腸道屏障功能受損而導(dǎo)致循環(huán)系統(tǒng)中來自于革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的脂多糖（LPS）水平升高。LPS可通過LPS-TLR4 / NF-kB 信號通路，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1 等的表達(dá)與釋放。后者通過損傷參與糖脂代謝調(diào)節(jié)的重要器官（如胰腺、肝、腎等）的靶細(xì)胞，最終引起T2DM 的胰島素抵抗及肥胖。IL-10 是一種重要的抗炎細(xì)胞因子，作為微生物抗原免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)因子發(fā)揮著重要作用。它能抑制巨噬細(xì)胞的活化，從而抑制其表達(dá)釋放炎性細(xì)胞因子，發(fā)揮抗炎的功效[13]。本研究中，模型組LPS和IL-6均高于正常組，而IL-10水平低于正常組，表明db/db 小鼠處于內(nèi)毒素血癥和慢性低度炎癥的狀態(tài)。而經(jīng)過8 個療程的干預(yù)治療，與模型組相比，序貫組的LPS和IL-6 水平降低，而IL-10 水平升高。該結(jié)果表明石斛合劑序貫法可以有效降低糖尿病小鼠的炎癥反應(yīng)，具有一定的抗炎作用。

綜上所述，石斛合劑序貫法能夠降低db/db 小鼠的血糖水平及胰島素抵抗、緩解內(nèi)毒素血癥、有效降低糖尿病小鼠的炎癥反應(yīng)。這可能與其通過促進(jìn)抗炎因子釋放、參與維持腸道穩(wěn)態(tài)、抑制內(nèi)毒素脂多糖進(jìn)入血液循環(huán)，從而降低糖尿病的胰島素抵抗和減弱慢性低度炎癥狀態(tài)有關(guān)。但其通過何種機(jī)制保護(hù)腸道穩(wěn)態(tài)和發(fā)揮抗炎作用，有待進(jìn)一步研究。