萊菔硫烷預先給藥對兔單肺通氣時肺損傷Nrf2蛋白變化及抗肺損傷的機制

李榮華 胡秀才 單士強 李永博 崔文斌 劉玲玲

(滄州市中心醫院麻醉一科,河北 滄州 061000)

臨床研究證實長時間的單肺通氣(OLV)可增加肺損傷發生的危險性，影響患者預后及術后康復〔1〕。核因子NF-E2相關因子(Nrf)2和急性肺損傷的發生密切相關，是機體中調節炎性反應、氧化/還原反應的重要轉錄因子〔2〕。萊菔硫烷(SFN)主要來源于甘藍、西蘭花、花菜等十字花科蔬菜中，屬于可食用的異硫氰酸鹽，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎性反應等作用，作為化學預防藥物已引起廣大研究者的關注〔3〕。研究報道，SFN能有效抑制重癥急性胰腺炎大鼠肺組織炎性反應，降低細胞氧化應激水平，減輕大鼠肺臟組織水腫〔4〕。本研究擬評價SFN預先給藥對OLV兔肺組織Nrf2蛋白表達的影響及機制。

1 材料與方法

1.1對象 取河北醫科大學實驗中心24只健康雄性大白兔，平均(5.01±1.21)月齡，體重2.3～3.5 kg，平均(2.86±0.45)kg，按照隨機數字表法分為雙肺通氣(TLV)組、OLV組及SFN預先給藥OLV(SFN)組各8只，其中TLV組3～7月齡，平均(4.89±1.12)月齡，體重2.3～3.3 kg，平均(2.81±0.43)kg；OLV組4～8月齡，平均(4.92±1.19)月齡，體重2.4～3.5 kg，平均(2.92±0.46)kg；SFN組3～8月齡，平均(4.05±1.25)月齡，體重2.3～3.5 kg，平均(2.83±0.43)kg，3組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。TLV組在氣管置入單腔氣管導管行雙肺通氣，OLV組、SFN組在右主支氣管置入單腔氣管導管行OLV。SFN組于OLV前30 min以5 mg/kg SFN行腹腔注射，OLV組和TLV 組同時點給予等量羥甲基纖維素鈉的溶媒。

1.2建立OLV模型 參照林文前等〔5〕研究方法建立OLV誘發肺損傷模型。將大白兔常規禁食水數小時后，給予30 mg/kg、3%戊巴比妥鈉于兔右側耳緣靜脈注射進行麻醉后，常規備皮，消毒。將右側股動脈游離以用于監測平均動脈壓(MAP，多道生理記錄儀 GY-6000F)及取動脈血行血氣分析(美國麥迪卡medica EasyStat 全自動血氣分析儀)。給予局麻將頸部皮膚切開，行氣管切開術。TLV組在氣管置入單腔氣管導管(ID3.0 mm)行TLV，OLV組、SFN組在右主支氣管置入單腔氣管導管(ID3.0 mm)行OLV(DHX-300動物呼吸機，北京金洋萬達科技有限公司)。導管位置通過聽診氣道壓力、右側呼吸音及觀察右側胸廓運動等變化進行判斷及調整。均采用容量通氣模式進行通氣，參數為氧濃度分數(FiO2)100%，血氧飽和度(SpO2)大于90%，TLV組雙肺通氣3 h，OLV、SFN組右肺OLV 3 h。將大白兔擺右側臥位，穩定10 min后將0.1 mg/kg維庫溴銨靜脈注射于右頸內，等無自主呼吸后將呼吸機連接行機械通氣。OLV組、SFN組先行50 min OLV，再行10 min雙肺通氣(將氣管導管退至氣管內，通氣參數如上)，再將上述通氣過程重復一遍。并在左側5～6肋間作一小切口至白兔胸腔，以對左肺復張及萎縮情況進行觀察。在術中給予0.1 ng/kg維庫溴銨、1% 1 ml戊巴比妥鈉間斷追加，以維持肌送和麻醉，再予10 ml/(kg·h)乳酸鈉林格氏液輸注于右頸內靜脈，以補給實驗過程中大白兔損失的體液，保障MAP穩定。在通氣開始(T0)、通氣1 h(T1)、2 h(T2)、3 h(T3)取動脈血檢測血氧分壓(PaO2)，再計算氧合指數(PaO2/FiO2)。實驗結束后將大白兔通過頸動脈快速放血法處死，摘除右肺稱濕重(W)，并取肺下葉1×1×2 cm3肺組織分成等大兩份，一份通過4℃ 4%多聚甲醛固定待測，另一份先用液氮凍存1 d再轉-80℃保存待測。將右肺放在80℃烤箱中烘烤72 h，再稱取干重(D)，計算W/D。

1.3肺組織病理學觀察 將1.0 cm3肺組織采用4%多聚甲醛固定常規脫水、包埋、切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，再通過光學顯微鏡觀察3組肺組織病理學改變，并進行肺損傷評分。每組切片均隨機選取10個高倍視野進行評分，取平均值。評估內容包括肺泡內充血、中性粒細胞浸潤、肺泡水腫、肺間質水腫等方面，計為0～4分，0分為輕微或無變化，1分為輕度變化，2分為中度變化，3分為重度變化，4分為極重度變化〔6〕。

1.4指標檢測 將-80℃保存的兔肺組織取出，通過化學比色法檢測超氧化物歧化酶(SOD)活性，丙二醛(MDA)含量，嚴格按照試劑盒(深圳子科生物科技有限公司)說明書進行檢測。其中通過硫代巴比妥酸法檢測MDA濃度，黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性。酶聯免疫吸附試驗檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6、IL-8濃度，嚴格按照試劑盒(合肥博美生物科技有限責任公司)說明書進行檢測。兔肺組織中的血紅素氧合酶(HO)-1、Nrf2濃度采用Western印跡法〔7〕進行檢測。

1.5統計學方法 采用SPSS18.0軟件行t檢驗、F檢驗、SNK-q檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.13組各時點氧合指數比較 3組T0、T1時氧合指數比較差異無統計學意義(P>0.05)，T2時OLV、SFN組明顯低于TLV組(P<0.05)，T3時OLV、SFN組明顯低于TLV組，但SFN組明顯高于OLV組(P<0.05)，T2、T3時OLV、SFN組明顯明顯低于T0時(P<0.05)，見表1。

表1 3組各時點氧合指數比較

2.23組相關指標比較 TLV組光鏡下結果顯示兔右肺組織中有完整性較高的肺泡結構，肺泡腔內較少炎性細胞浸潤，間質輕度增厚，出血少，未見明顯滲出；OLV組兔右肺組織中較多肺泡結構消失，肺泡腔內較多炎性細胞浸潤，間質增厚明顯，出血多，滲出明顯；SFN組兔右側肺組織肺泡結構有破壞，肺泡腔內較少炎性細胞浸潤，間質增厚，出血少，少量滲出。OLV組、SFN組Nrf2、HO-1蛋白表達、肺損傷評分、W/D明顯高于TLV組(P<0.05)，SFN組Nrf2、HO-1蛋白表達明顯高于OLV組，肺損傷評分、W/D明顯低于OLV組(P<0.05)，見表2。

表2 3組相關指標比較

2.33組氧化應激及炎性因子指標比較 OLV組、SFN組MDA表達及TNF-α、IL-6、IL-8濃度明顯高于TLV組，SOD活性明顯低于TLV組(P<0.05)，SFN組MDA表達及TNF-α、IL-6、IL-8濃度明顯低于OLV組，SOD活性明顯高于OLV組(P<0.05)，見表3。

表3 3組氧化應激及炎癥因子指標比較

3 討 論

非通氣側肺主要是由肺組織的再灌注損傷、復張時機械牽張性損傷及萎陷時的缺氧性損傷所導致，通氣側肺則由通氣過量所引起的機械通氣性肺損傷及所誘發的肺組織炎性反應所致〔8，9〕。研究報道，OLV所誘發的肺損傷可能和脂質過氧化反應及炎性反應增加密切相關〔10〕。因終末肺泡的氧供主要來源于肺動脈及肺泡內氣體，而肺動脈中是混合靜脈血，OLV時萎陷的肺泡缺氧及可發生缺氧性肺血管收縮，進而導致肺組織低氧狀態。肺泡的萎陷與復張及缺氧可增加氧化應激反應，生成過量的氧自由基，同時可激活中性粒細胞在肺組織中聚集，從而生成大量的炎性介質。生物膜上的不飽和脂肪酸可與氧自由基發生脂質過氧化作用，生成MOD等脂質過氧化物，對生物膜造成破壞，從而可直接對肺實質細胞造成損傷〔11〕。此外MOD等脂質過氧化物還可對肺毛細血管基底膜等肺間質成分，誘發肺水腫。SOD可有效將機體中氧自由基清除，但當MOD等脂質過氧化物過量時可消耗大量SOD，降低血中活性。TNF-α、IL-6、IL-8等炎性因子促發的肺組織炎性反應，可對血管內皮細胞、肺泡上皮細胞造成損傷，導致肺毛細血管通透性增加、肺泡上皮細胞變性壞死及肺血管痙攣，進而引起肺泡及間質炎性細胞浸潤、水腫及出血，導致肺損傷〔12，13〕。

Nrf2是調節炎性反應、氧化/還原反應的重要轉錄因子，正常情況下Nrf2與Keapl結合在胞質中，并在肌動蛋白構成的細胞骨架上固定，不能進到細胞核中發揮轉錄活性作用，且被相關蛋白酶體途徑降解。當細胞受到親電子化合物、活性氧簇等刺激時，可與Keapl分離，進入細胞核中合成異二聚體結合ARE序列，從而可啟動Ⅱ相解毒酶基因及抗氧化應激蛋白基因等受ARE調控的相關基因轉錄，受ARE調控的基因大多可編碼多種抗炎、抗氧化作用的蛋白如HO-1、醌氧化還原酶1等〔14，15〕。其中HO-1具有顯著的抗炎、抗氧化作用，可有效抑制炎性反應，降低肺損傷程度。而抗氧化酶類可發揮抗氧化功能，清除自由基，保障肺組織的正常功能〔16〕。SFN屬于異硫氰酸酯類，具有保護細胞、抗氧化、抗炎、抗癌等多種生理學功能。研究發現，SFN能通過Nrf2途徑上調HO-1、NADPH泛醌氧化還原酶-1等抗氧化酶表達，最終在機體內發揮抗氧化功能〔17〕。周亞東等〔18〕研究指出，SFN可以通過激活動物體內Nrf2信號傳導通路，調節下游多種細胞因子表達，進而緩解組織中的炎性反應，推測Nrf2可以當作肺保護性治療的一個靶點。氧合指數在臨床上常用于反映呼吸功能，當低于300 mmHg時可認為有急性肺損傷〔19〕。本研究結果提示，SFN預先給藥可減輕肺損傷；另外，SFN可促進肺組織中Nrf2表達，提高HO-1等抗氧化酶濃度，發揮抗氧化、抗炎作用；SFN也可有效抑制肺組織中脂質過氧化反應及炎性反應，可通過激活Nrf2表達，上調HO-1等下游多種細胞因子的表達來發揮抗氧化、抗炎作用及自身的抗氧化、抗炎等生理學功能發揮協同抗氧化和抗炎的雙重生物學作用，從而達到肺組織損傷的保護作用。