二陳湯加味對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織沉默信息調節因子1、內皮素-1表達的影響

宋倩紅 李進京 王俊月 李亮 牛賀 王肖艷 謝文英 包永生

(河南中醫藥大學基礎醫學院，河南 鄭州 450046)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)以不可逆的氣流受限為主要特征,其臨床發病率在我國逐年上升,已成為所有疾病中第3位的心理負擔和死因〔1,2〕。COPD對患者的負面心理情緒和近期感受到的心理敵意明顯高于其他正常人〔3〕，在目前的臨床治療方法中,常用藥物有糖皮質激素、支氣管激素和舒張抑制劑等,只能近期暫緩其癥狀,遠期的療效仍有待確認,且其耐藥性與不良反應都是加重疾病患者的心理和精神負擔的重要原因〔4〕。二陳湯加味可以通過增強機體免疫功能、抗氧化損傷及炎癥反應保護肺部氣道的結構及有效發揮其遠期的療效,減少了病人的發病時間和次數〔5～11〕。研究結果顯示許多COPD患者的沉默信息調節因子(Sirt)1表達與患者抗氧化細胞損傷及其代謝產物炎癥反應呈明顯的負相關,且Sirt1可通過抑制核轉錄因子(NF)-κB細胞轉錄直接發揮其顯著的抗炎作用,并激活內皮素(ET)-1,而生長因子ET-1可直接增強平滑肌中細胞的正常增殖,能直接加重COPD患者平滑肌的細胞肥厚,以至肺血管壁因之增厚，并進一步導致管腔狹窄,使血管功能衰減〔12～15〕。本實驗觀察二陳湯加味對COPD大鼠模型肺組織中Sirt1、ET-1蛋白表達的影響，探討其藥效機制。

1 材料與方法

1.1動物與飼料 SD大鼠50只，雄性，SPF級，7～8周齡， 體重(200±20)g(由濟南朋悅公司提供)；合格證編號SYXK(豫)2012-0009(由河南省中醫研究院動物實驗中心提供)；生長飼料，許可證號：蘇飼證(2014)01008(由江蘇協同有限公司提供)。倫理審查批準編號DWLL20130018。

1.2藥物及試劑 二陳湯加味的組成：茯苓20 g(批號1509006W)，陳皮10 g(批號 1509002S)，枳殼10 g(批號1510002W)，半夏10 g(批號 1501001S)，地龍10 g(批號1511002 S)，山藥20 g(批號 1509003S)，黨參25 g(批號 1511003W)，葶藶子15 g(批號 1510001S)，白術15 g(批號 1510004 S)，桂枝3 g(批號 1510002S)，杏仁10 g(批號 1512002S)，炒蘇子20 g(批號1512001S)，炙麻黃6 g(批號 1509001S)。以上藥物均由華潤三九醫藥公司提供，為中藥配方顆粒。兔抗大鼠Sirt一抗(三鷹Proteintech中國分公司，批號13161-1-AP)。脂多糖(LPS，美國SIGMA公司，批號025M40400V)。小鼠單克隆抗體ET-1(Abcam，批號GR270664-3)。二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德公司，批號11I18B22)。逆轉錄試劑盒(南京諾唯贊公司，批號119041)。總RNA提取試劑盒(南京諾唯贊公司，批號086001)。

1.3儀器 全自動染色機(ST5020)、半自動輪轉式切片機(RM2245)、自動組織脫水處理機(TP1020-1，徠卡上海分公司)。BX51+CCD全自動病理圖像采集和分析系統(日本Olympus公司)。生物顯微鏡、顯微攝影儀(麥克奧迪公司，BA210)。inspira呼吸機(日本光電公司)。TopScan肺功能測量系統(吉安德爾公司)。實時熒光定量PCR儀(美國Applied biosystem公司)。

1.4動物造模及分組給藥 50只大鼠分為正常組、二陳湯加味低、中、高劑量組、模型組，每組10只。制備COPD的大鼠模型〔16～20〕如下：將需造模的40只SD大鼠置于自制透明且封閉的煙薰箱內煙薰，每次以香煙10支進行煙熏實驗，持續30 min，2次/d。分別于第1、13日，對需造模的大鼠氣管內注入LPS (1 mg/ml)0.2 ml，而正常組則注入等量生理鹽水。完成造模實驗后〔15〕，對造模組灌胃治療，二陳湯加味低、中、高劑量組分別以10、20、40 g/(kg·d)給藥，時間為10點和16點，灌胃分別各一次，每次3 ml。正常與模型組則注入等體積生理鹽水，且稀釋度亦為6 ml/d，持續給藥14 d。

1.5大鼠一般狀況觀察 體量增減、毛皮色澤變化、食量狀況及鼻腔分泌物，并及時更新跟進研究過程，出現死亡時，探明其死因，并做好跟蹤記錄。

1.6大鼠肺功能檢測 大鼠COPD氣道重塑持續發病時，勢必誘發肺功能持續抑制，肺功能測定作為COPD的最重要診斷標準之一。檢測具體操作為，每只大鼠將分別置于與感應器相連接的體積描記箱中，計算出潮氣量(VT)和呼氣峰流速〔20〕。

1.7免疫組化法檢測ET-1、Sirt1的蛋白表達 切片脫蠟，使用3%的過氧化氫進行封閉，抗原修復完成后采用5%的牛血清蛋白(BSA)液進行封閉，并滴加一抗ET-1、Sirt1工作液，再滴加山羊抗免疫球蛋白(Ig)G二抗，DAB顯色，復染。陽性片陽性對照，磷酸鹽緩沖液陰性對照。免疫組化表現為陽性之根據是棕黃色的肺組織鏡下觀。每組的免疫組化切片，隨機選取其中的6個高倍鏡視野，使用顯微鏡圖像分析軟件(IPP)，計算陽性顯色的平均光密度值，并將數據進行整理分析。

1.8實時熒光定量PCR法檢測ET-1、Sirt1的mRNA表達 將研碎肺組織置于PE管中，并加組織裂解液與氯仿萃取劑，在混勻之后，采取多次離心的方法，并在提取以及洗脫之后，以總RNA提取試劑盒提取肺組織中總RNA。用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA，并用實時熒光定量PCR儀進行PCR擴增，Sirt-1引物：上游5′-CAAAGGAGCAGATTAGTAGGCG-3′，下游5′-CTCTGGCATGTCCCACTATCAC-3′；ET-1引物：上游5′-TCTTCTCTCTGCTGTTTGTG-3′，下游5′-TAGTTTTCTTCCCTCCACC-3′,GAPDH：上游 5′-AGGGCTGTTCGTGAGCACA-3′，下游 5′-GAGCCCCAGCCTTCTCCATG-3′，然后計算各組 Sirt1 mRNA 相對表達量。

1.9統計學分析 運用SPSS21.0進行非參數檢驗或方差分析。

2 結 果

2.1健康情況 實驗結束后，正常組狀態較為良好，且動作十分敏捷，無各種異常及死亡發生。模型組體重與造模之前相較則明顯降低，毛枯皮槁，精靡神萎，呼吸頻率明顯加快，鼻腔可見不等的分泌物，且死亡2只。治療各組相較于模型組有整體的改善。其中低劑量組與造模前相較，體重整體下降，且死亡1只。高、中劑量組體重較前整體呈增長趨勢，無死亡。

2.2肺功能影響 與正常組相比，模型組TV及呼氣流量峰值(PEF)均顯著抑制(P<0.01)；與模型組相較，二陳湯加味各個劑量組TV、PEF均顯著升高(P<0.01)。見表1。

2.3肺組織Sirt1、ET-1蛋白和mRNA表達的影響 細胞核鏡下的棕黃色顆粒為Sirt1的陽性表達，部位主要為巨噬細胞核及支氣管上皮細胞胞核；陽性表達的ET-1在鏡下可見細胞質中含有棕黃色的顆粒，部位表達為肺泡壁、細支氣管上皮細胞胞質；正常組表達為陰性或弱陽性(圖1)。與正常組比較，模型組Sirt1的蛋白和mRNA表達顯著抑制(P<0.01)；與模型組比較，二陳湯加味低、中、高劑量組Sirt1的蛋白和mRNA表達均顯著升高(P<0.01)。與正常組比較，模型組ET-1的蛋白和mRNA表達顯著增強(P<0.01)；與模型組相較，各劑量組ET-1蛋白和mRNA表達明顯降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組肺功能、肺組織Sirt1、ET-1蛋白和mRNA表達

圖1 各組肺組織Sirt1、ET-1蛋白表達(DAB，×400)

3 討 論

COPD的疾病特征為持續發展進行性氣流受限，伴有害氣體或顆粒所致的肺和氣道的慢性炎癥反應增加，從而誘使患者的肺功能進行性下降，具有高度的致殘性，甚至部分患者會因之而喪失部分勞動能力〔21〕。其中氣道重塑持續在 COPD 的整個發病過程，亦為COPD氣流受限呈不可逆的主要病理基礎〔22〕。雖然西藥能在一定程度上對癥狀起到緩解作用，減少其并發癥，但由于COPD 的復雜發病機制，現代醫學的各種防治措施對患者肺功能持續惡化的阻止作用仍顯不足，尚不能從根本上改變COPD患者的肺功能持續下降趨勢，且藥物治療多存在程度不等的毒副作用。

中醫將 COPD 歸屬為肺脹、咳嗽、痰飲等范疇，肺主氣，司呼吸，外邪侵襲，肺失宣降，久之則痰瘀膠結，伏于肺絡，阻塞氣道成為“宿根”，損傷正氣〔23〕。因此COPD的治療當以祛痰與健脾兼治，并結合患者的臨床辨證，隨癥加減。而二陳湯具有燥濕化痰、理氣和中的功效，乃祛痰之通劑〔24〕，始見于宋代《太平惠民和劑局方》。選用二陳湯加味治COPD，方中既有半夏、陳皮、茯苓之燥濕化痰、理氣和中，又有黨參、白術、山藥之健脾益氣扶正，再稍佐麻黃、桂枝、杏仁、蘇子等宣肺散寒、化痰平喘，全方標本兼顧，扶正以祛邪，在臨床上取得較好的療效。

細胞因子和炎癥介質所誘發的慢性炎癥與COPD的發病息息相關。研究表明，Sirt1可以通過與不同的靶蛋白結合，以響應細胞外刺激，進而參與COPD的發生進展〔25〕。馬南等〔26〕研究證實Sirt1具有對炎癥反應的抑制作用，可為治療COPD提供有意義靶點。杜強等〔27〕研究發現Sirt1表達降低可能是導致COPD風險增高的重要因素。黃紅銘等〔28〕研究發現益肺膠囊可能通過上調Sirt1蛋白濃度以顯著提升患者的肺功能，進而治療COPD。而ET-1是一種內源性血管收縮因子，肺是ET-1作用最敏感的靶器官，研究表明〔29〕ET-1 廣泛參與呼吸系統疾病的發病機制，具有重要的生理功能。ET-1可通過調控細胞凋亡、基質金屬蛋白酶動態平衡及炎癥、氧化應激過程參與肺氣腫的病理機制，從而上調在 COPD 患者中的表達量〔30〕。ET-1 還可以通過促進中性粒細胞的黏附作用，從而加重炎癥反應〔31〕。而ET-1的興奮可作用在平滑肌細胞，促使肺血管增殖肥厚，誘發血管重建〔32〕。因此，ET-1與Sirt1對COPD病程進展中的炎癥反應及氧化損傷、血管結構重建有著重要作用。