OPN和VEGF的表達在老年乳腺癌復發轉移中的意義

劉偉 陳宗義 劉道生 洪偉 楊德盛 陳佳

(1遵義市第一人民醫院 遵義醫科大學第三附屬醫院，貴州 遵義 563000；2遵義市紅花崗區人民醫院；3秦皇島市中醫醫院 河北中醫學院附屬醫院)

乳腺癌好發于老年女性，發病率呈不斷上漲趨勢，具有較高死亡率，嚴重影響老年女性的身心健康及生命安全〔1〕。早期發現、診斷、治療乳腺癌是提高生存率的關鍵。目前臨床治療乳腺癌雖然以綜合治療為主，但手術治療仍不能忽視，且手術可有效清除病灶，對于手術患者進行定期隨訪、監測仍至關重要，可為復發轉移的防治提供重要依據〔2〕。近年來，臨床對乳腺癌復發轉移的檢測方法較多，不少學者認識到，腫瘤的發生是多基因參與及多步驟發生的過程，腫瘤標志物可能與乳腺癌的復發轉移具有密切關系。近期有學者發現骨橋蛋白(OPN)在乳腺癌的發展過程中起到十分重要作用，但關于此項研究仍在初步階段〔3〕。此外，血管內皮生長因子(VEGF)是腫瘤生成過程中特異性最高的促血管生長因子，對腫瘤血管的生成起到重要誘導作用〔4〕。目前臨床常常將OPN、VEGF關系應用在肝癌、肺癌研究中，對乳腺癌的研究尚不多見，尤其是其聯合表達在乳腺癌復發轉移中的意義。本研究旨在探討OPN、VEGF表達在老年乳腺癌復發轉移中的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性收集2009年1月至2014年12月在遵義市第一人民醫院行乳腺癌手術且獲得隨訪的62例乳腺癌患者臨床資料，根據5年內是否發生復發，將其分為5年內復發轉移組37例(A組)及無瘤生存5年及以上組25例(B組)。另收集2015年1月至2019年1月期間遵義市第一人民醫院接收的正常乳腺組織(良性腫瘤旁組織)15例患者臨床資料，將其設為C組。患者均為女性，年齡60～75歲，平均(68.56±5.32)歲。納入標準：①所有患者符合《中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范》〔5〕中診斷標準；②入院之前未進行放化療等相關治療。③年齡60～75歲；④所有患者臨床資料完整且影像學資料清晰；⑤復發或轉移時進行活檢經病理證實為乳腺癌復發或者轉移。排除標準：①合并嚴重心、肝、腎等重要臟器病變者；②合并其他惡性腫瘤者；③合并感染性疾病或免疫系統疾病；④精神疾病患者或認知功能障礙者。3組一般資料差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組一般資料對比

1.2方法

1.2.1檢測血清中OPN和VEGF水平 采集所有患者當日清晨空腹靜脈血5 ml，2 500 r/min離心15 min，取上清液，放置在-20℃的冰箱中保存待檢，血清中OPN(美國R&D公司提供試劑盒)、VEGF水平(上海西塘生物科技有限公司提供試劑盒)采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定。不同水平檢測均嚴格按照各自試劑盒說明書進行。

1.2.2檢測病理組織中OPN和VEGF表達 儀器：北京中杉金橋生物科技有限公司提供的ZM-0174型兔抗人OPN多克隆抗體；兔抗人VEGF單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司，BA0407)；試劑：武漢博士德生物工程有限公司提供的SP-9001型免疫組織化學染色試劑盒；北京博奧森生物技術有限公司提供的二氨基聯苯胺染色試劑；上海之信儀器有限公司提供的YD-1508R石蠟切片機；光學顯微鏡(南京江南光電集團股份有限公司，XS-200)。病理組織中的OPN、VEGF表達通過免疫組織化學法檢測，取組織標本，通過甲醛溶液進行固定，對其進行脫水，透明1 min(二甲苯中)，給予常規包埋；對石蠟標本連續切片(厚4 μm)；對其進行脫蠟及水化；并放入到磷酸鹽緩沖液(PBS)中沖洗3次，3 min/次；通過在乙二胺四乙酸95℃下進行修復抗原15 min，使得抗原充分暴露；置于3% H2O2室溫下孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶活性；滴加封閉用正常山羊血清工作液15 min，以減少組織中非特異性染色，傾去余液；加入一抗工作液(OPN、VEGF的濃度分別為1∶100、1∶150)，置于4℃冰箱濕盒內過夜，PBS沖洗3次，3 min/次；滴加生物素化二抗工作液，在37℃下孵育10 min，PBS沖洗3次，3 min/次；再次進行滴加SP試劑，并孵育15 min，采用PBS進行沖洗，3次，3 min/次；并通過二氨基聯苯胺顯色10 min，用蒸餾水進行沖洗，通過蘇木精進行復染，給予常規脫水、透明及封片等處理；在光學顯微鏡下進行觀察并拍照。

1.3OPN和VEGF免疫組織化學評定標準〔6〕評估方法為雙盲法，當結果不一致時，可由2名以上的高資歷醫師共同商討，最終確定結果。OPN染色主要定位在腫瘤細胞質，呈現棕黃色、彌漫狀、間質少有染色；VEGF染色主要定位在癌細胞質，呈棕黃色，彌漫狀，間質少有染色。在高倍顯微鏡下(×400)，采用隨機方式選擇5個視野，200個腫瘤細胞/視野，將陽性細胞所占的比例計為a，染色強度計為b，根據a和b兩方面進行分別計分，將a與b的乘積進行半定量分析。其中a計分如下：0分：無陽性細胞、1分：1%～10%、2分：11%～25%、3分：26%～50%、4分：51%～75%、5分：≥76%；b計分如下：0分：無著色、1分：淡黃色或黃色、2分：棕黃色、3分：棕褐色。以a與b的乘積作為最終得分，其中分數>3分為陽性，≤3分為陰性。

1.4統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行χ2檢驗，t檢驗；繪制受試者工作特征(ROC)曲線并計算曲線下面積(AUC)值。

2 結 果

2.1血清中OPN和VEGF水平對比 A組血清中OPN、VEGF水平明顯高于B、C組，B組血清中OPN、VEGF水平明顯高于C組(均P<0.05)。見表2。

表2 3組血清中OPN和VEGF水平對比

2.23組病理組織中OPN和VEGF陽性表達比較 A組OPN、VEGF陽性表達率均明顯高于B組、C組，且B組OPN、VEGF陽性表達率均明顯高于C組(P<0.05)。見表3。

表3 3組病理組織中OPN和VEGF陽性表達率比較〔n(%)〕

2.3血清OPN和VEGF水平用于預測乳腺癌患者復發轉移的價值分析 血清OPN、VEGF用于預測乳腺癌患者復發轉移的AUC分別為0.723、0.707，預測價值好。見表4，見圖1。

表4 血清OPN和VEGF水平用于預測乳腺癌患者復發轉移的價值

圖1 血清中OPN、VEGF預測乳腺癌復發轉移的ROC曲線

2.4病理組織中OPN和VEGF陽性表達用于預測乳腺癌患者復發轉移的價值分析 病理組織中OPN和VEGF陽性表達用于預測乳腺癌患者復發轉移的曲線下面積分別為0.711、0.706，預測價值好。見表5，見圖2。

表5 病理組織中OPN和VEGF陽性表達用于預測乳腺癌患者復發轉移的價值

圖2 病理組織中OPN、VEGF表達預測乳腺癌復發轉移的ROC曲線

3 討 論

乳腺癌發病率位居女性惡性腫瘤第一位〔7〕。該病多發于中老年女性群體，乳腺癌術后復發及轉移是造成患者死亡的重要原因之一，可見，給予乳腺癌患者早期科學有效的診斷，對降低術后復發、轉移，提高生存率具有十分重要的作用。學者認為〔8〕年齡、病理分期、組織學分級、手術方式等因素與乳腺癌患者的預后具有重要關系，但在臨床上醫師常發現，患者年齡、分期及病理類型等情況基本相近的乳腺癌患者，其預后也不盡相同，分析其原因在于，惡性腫瘤的發展受到多基因、多步驟等影響，故尋求更多影響乳腺癌患者預后的因素，成為臨床目前研究的重點，這對提高無瘤生存率起到至關重要的作用。最近研究發現OPN是一種帶負電荷且具有親水性的糖蛋白，其可通過巨噬細胞、骨細胞等多種腫瘤細胞分泌，參與多種病理生理過程，且在乳腺癌發展過程中起到重要作用，但是OPN與VEGF聯合及單獨表達與乳腺癌復發轉移相關性類研究仍處于初涉階段〔9，10〕。

OPN基因的表達具有組織細胞特異性，受到多種生長因子、激素等的調控，在特定病理條件下，OPN能夠與多種整合素受體及CD44相互結合，不僅能夠促進腫瘤血管形成，也可使得腫瘤細胞發生增殖、侵襲，對抑制細胞凋亡等起到十分重要的作用〔11，12〕。近年來，有研究顯示，乳腺癌發生受到OPN表達的影響，其在乳腺癌的發展、病變過程中起到至關重要的作用，臨床可通過檢測OPN水平，判斷患者預后〔13〕。本研究結果表明OPN在乳腺癌組織中具有較高表達，可評價乳腺癌患者復發情況。很多學者與本實驗具有相似的結論，高金亮等〔14〕研究認為OPN對評估乳腺癌生物學行為及患者預后具有一定的價值，OPN的表達強弱與乳腺癌惡性程度具有密切關系，正常患者OPN值為14～46 μg/L，若與該值差異較大，則提示乳腺癌已發生轉移。VEGF是一種可以由多種細胞分泌的糖蛋白，具有較高的血管滲透性，VEGF為腫瘤細胞的生長、新生毛細血管網的建立提供十分重要的營養基礎；此外，VEGF也是一種具有高度特異性的血管內皮細胞有絲分裂原，對腫瘤細胞的快速生長具有一定促進作用〔15，16〕。本研究結果可見VEGF對乳腺癌的預后具有顯著影響，可評價乳腺癌復發情況。分析其原因在于，VEGF是重要的血管內皮生長因子，具有較高特異性，在腫瘤血管生成中起到重要作用，可誘導腫瘤血管生成，而乳腺癌的生長、復發及轉移是依賴血管生成〔17，18〕。繪制ROC曲線結果顯示，血清、病理組織中OPN和VEGF用于預測乳腺癌患者復發轉移的預測價值好。