支氣管肺泡灌洗液SHOX2和RASSF1A基因甲基化檢測在臨床肺癌早期診斷中的應用

田祺 趙靖 劉菲菲 羅坤 尹小波 王曉杰 徐淑鳳

(秦皇島市第一醫院呼吸與危重癥醫學科，河北 秦皇島 066000)

肺癌具有侵襲性高、生長迅速、預后差及復發率高等生物學特點〔1〕，其發病率和病死率在世界范圍內均位居各種惡性腫瘤的首位，嚴重威脅人類的健康及生命安全。我國肺癌發病率及死亡率也位列惡性腫瘤首位〔2〕。肺癌預后差，5年生存率僅為16.1%〔3〕。目前尚無針對肺癌的有效篩查方法，這可能是死亡率高的原因之一。于起病初期發現，進行手術切除是僅有的治愈方法，早期肺癌患者術后5年生存率可達90%〔4〕。因此，肺癌的早期診斷與預后密切相關。但肺癌早期臨床表現多無特異性，難以及時察覺，80%患者在診斷時已是晚期(Ⅲ或Ⅳ期)，致使患者的 5年存活率不超過15%〔5,6〕。近年來，腫瘤標志物檢測作為肺癌的輔助診斷工具受到更多重視。但目前尚未發現早期肺癌的特異性抗原，用于檢測的腫瘤標志物均為非特異性物質，且對特定腫瘤標志物的檢測，往往僅對單一某種病理類型具有較高的靈敏度和特異度，而對總體肺癌的靈敏度和準確率不高，早期診斷價值十分有限〔5～7〕。

目前，纖維支氣管鏡檢查是對疑似肺癌患者進行組織學或細胞學檢查的標準檢查方法。支氣管鏡檢查為微創技術，與其他有創操作相比引發并發癥的概率小，具有較高的特異度，但支氣管鏡檢查診斷準確性相對較差，敏感度為30%～69%〔8,9〕。與傳統血液相比，支氣管肺泡灌洗液(BALF)更靠近腫瘤細胞，是肺癌生物標志物的另一來源。DNA甲基化對于基因表達的調控至關重要，通過改變DNA甲基化而發生的表觀遺傳改變在多種癌癥類型的發生中起重要作用〔10,11〕。相關證據表明，矮小同源盒基因(SHOX)2和RAS關聯域家族(RASSF)1A的啟動子甲基化已被確定為肺癌的診斷和預后的生物標志物〔12,13〕。本文擬綜合評價BALF中基因SHOX2、RASSF1A甲基化和細胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)、癌胚抗原(CEA)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)、鱗狀細胞癌抗原(SCCAg)4種腫瘤標志物檢測對早期肺癌診斷的價值，并探討不同指標聯合檢測的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1～12月在秦皇島市第一醫院就診疑似早期肺癌進行纖維支氣管鏡檢查的153例患者。經過一系列排除標準，最終134例進入研究。所有患者根據組織學結果進行最終診斷，腫瘤分期參照2010年修訂的美國癌癥聯合委員會(AJCC)分期體系(第7版)確定。其中67例早期肺癌患者納入肺癌組，67例良性病變患者納入對照組。肺癌組男30例，女37例，平均年齡58歲，鱗狀細胞癌32例，腺癌27例，小細胞肺癌8例；對照組男33例，女34例，平均年齡59歲，肺部感染30例、結核20例、支氣管擴張等良性疾病17例。兩組基線資料比較差異無統計學意義(P>0.05)；肺癌組肺泡灌洗液甲基化結果，SHOX2及RASSF1A基因的ΔΔCT值(7.15±4.82、6.47±3.87)比較差異無統計學意義(t=0.908，P>0.05)。

1.2收集BALF標本 纖維支氣管鏡術前向患者及家屬交代纖維支氣管鏡檢查目的、風險及注意事項，并簽署知情同意書。術前進行吸氧、生命體征檢測，術中對所有患者經鼻插入纖維支氣管鏡，先檢查健側支氣管，再根據患者胸部 CT 對病變部位進行檢查，用20～40 ml生理鹽水沖洗病變肺段。以10 000 r/min離心5 min的10 ml BALF沉淀用于DNA提取。提取基因組DNA采用標準的DNA提取試劑盒(TIANamp基因組DNA試劑盒，天根生物技術有限公司，中國北京)，并使用EZ DNA甲基化試劑盒(Zymo Research，美國)用亞硫酸氫鹽將未甲基化的胞嘧啶修飾為尿嘧啶。立即檢測DNA樣品或將其保存在-80℃。

1.3腫瘤標志物檢測 入院第2天抽取晨起空腹靜脈血5 ml，采用羅氏 Elecsys2010 電化學發光全自動免疫分析儀及配套試劑檢測CEA、NSE、SCCAg、CYFRA21-1。所有過程由經驗豐富的醫師按照說明書操作完成。

1.4RT-PCR 用人甲基化SHOX2和RASSF1A基因檢測試劑盒(上海透景生命科技股份有限公司)分析未修飾的DNA。基因組DNA中未甲基化的C堿基被亞硫酸鹽修飾為U堿基，然后在PCR擴增過程中被修飾為T堿基，而甲基化的C堿基保持不變，因此可以區分甲基化和未甲基化的C堿基。使用TaqMan探針，以甲基化的SHOX2和RASSF1A DNA質粒為對照，通過TaqMan探針檢測使用針對不同序列的特異性引物進行PCR擴增的產物。

1.5統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、多因素Logistic回歸分析，構建受試者工作特征(ROC)曲線，計算截斷值，計算ROC曲線下面積(AUC)以評估診斷效果。

2 結 果

2.1SHOX2及RASSF1A甲基化檢測情況 采用 RT-PCR 法檢測BALF，基因SHOX2甲基化診斷靈敏度為80.6%，特異度為82.1%，診斷準確率為81.3%；其中肺癌組SHOX2陽性54例，陰性13例；對照組陽性12例，陰性55例。BALF基因RASSF1A甲基化，靈敏度為79.1%，特異度為85.1%，診斷準確率為82.1%；其中肺癌組RASSF1A陽性53例，陰性14例；對照組陽性10例，陰性57例。血清腫瘤標志物Cyfra21-1、CEA、NSE、SCCAg對肺癌診斷的敏感度、特異度分別為：56.7%、85.1%；37.3%、80.6%；49.3%、89.6%；26.9%、80.6%。SHOX2及RASSF1A與血清腫瘤標志物Cyfra21-1(χ2=8.87、7.71)、CEA(χ2=25.94、24.05)、NSE(χ2=14.45、12.98)、SCCAg(χ2=39.90、36.69)對早期肺癌診斷的靈敏度差異有統計學意義(均P<0.05)。

2.2多因素Logistic回歸分析 以是否患有肺癌(賦值：是=1，否=2)為因變量，Cyfra21-1、CEA、NSE、SCCAg、SHOX2 ΔΔCT及RASSF1A ΔΔCT值為自變量，結果顯示Cyfra21-1、NSE、SHOX2 ΔΔCT及RASSF1A ΔΔCT值是肺癌的影響因素(P<0.05)，見表1。

表1 BALF基因RASSF1A、SHOX2甲基化、腫瘤標志物對肺癌影響的多因素Logistic 回歸分析

2.3BALF基因SHOX2、RASSF1A甲基化ΔΔCT值、血漿Cyfra21-1、NSE診斷早期肺癌的ROC 曲線 以上述指標為檢驗變量，以是否患肺癌為分類變量繪制ROC 曲線，結果顯示SHOX2 ΔΔCT值診斷肺癌的AUC 為0.846，最佳截斷值為10.7時，靈敏度為83.6%，特異度為84.0%；基因RASSF1A ΔΔCT值診斷肺癌的AUC為0.809，最佳截斷值為14.5時，靈敏度為88.1%，特異度為80.6%；血清Cyfra21-1值診斷肺癌的AUC為0.792，最佳截斷值為3.4時，靈敏度為55.2%，特異度為85.2%；血清NSE值診斷肺癌的AUC 為0.784，最佳截斷值10.7時，靈敏度為58.2%，特異度為86.6%；SHOX2、RASSF1A基因ΔΔCT值診斷肺癌的AUC，顯著高于Cyfra21-1 AUC值(Z=-9.722、-9.389，P<0.05)，但與NSE診斷肺癌AUC值差異無統計學意義(Z=-1.477、-1.191，P=0.14、0.23)；以SHOX2 ΔΔCT值聯合RASSF1A基因ΔΔCT值為檢驗變量，繪制ROC曲線，診斷肺癌的AUC值為0.935，靈敏度升高至91.0%，特異度升高至88.1%，顯著高于SHOX2、RASSF1A、NSE和Cyfra21-1診斷肺癌的ROC曲線(Z=-14.171、-14.176、-14.174、-14.173，均P<0.05)。見圖1～3。

圖1 血清腫瘤標志物Cyfra21-1、CEA、NSE、SCCAg對早期肺癌診斷的ROC曲線

圖2 SHOX2、RASSF1A ΔΔCT值對早期肺癌診斷的ROC曲線

圖3 SHOX2聯合RASSF1A ΔΔCT值對早期肺癌診斷的ROC曲線

3 討 論

SHOX2甲基化于2010年作為一種生物標志物被引入，研究表明其能夠在523個有效測量樣本的病例對照研究中區分惡性和良性疾病，靈敏度為68%，特異性為95%〔14〕。在2011年進行的343個有效標本的病例對照研究中，SHOX2生物標志物在血漿中的表現靈敏度為60%，特異性為90%〔15〕。近年來，國內外研究多次對肺癌患者進行了血漿樣本中SHOX2和RASSF1A的甲基化分析，揭示了肺癌早期診斷與檢測SHOX2和RASSF1A基因異常甲基化變化之間的關系，然而，血漿標本中SHOX2檢測靈敏度(60.00%)和RASSF1A基因(52.4%)并不能令人滿意〔16～18〕。

研究表明，在患者體內的5種標本中均可獲得SHOX2及RASSF1A基因甲基化的陽性結果，包括淋巴結、胸腔積液、BALF、腫瘤組織、外周血。其中，BALF是一種通過纖維支氣管鏡檢查容易獲得的無創標本，是疑似肺癌患者的常規檢查項目。由于其鄰近腫瘤細胞，BALF的SHOX2及RASSF1A基因甲基化可望成為肺癌早期篩查的重要工具。

本研究結果證實，BALF的SHOX2及RASSF1A基因甲基化對肺癌的早期診斷具有高效的診斷能力，有可能成為一種有前途的肺癌診斷生物標志物，并在早期肺癌診斷中作為細胞學的輔助工具。

本研究結果提示，血清Cyfra21-1、NSE及SHOX2、RASSF1A基因甲基化水平可在一定程度上獨立反映早期肺癌的情況，這與Schneider等〔19〕關于SHOX2 基因甲基化及Korse等〔18〕關于腫瘤標志物對肺癌診斷的研究結果具有較好的一致性。單一的SHOX2及RASSF1A基因甲基化對早期肺癌輔助診斷存在價值，SHOX2 基因甲基化診斷早期肺癌靈敏度為80.6%，特異度為82.1%，RASSF1A 基因甲基化，靈敏度為79.1%，特異度為85.1%。而單一的腫瘤標志物對早期肺癌診斷的臨床應用價值有限，本試驗表明聯合SHOX2及RASSF1A具有成為肺癌早期診斷的重要生物標志物的潛力。相關研究表明，BALF中的生物標志物具有比血清樣品更早出現，濃度更高的特點〔20〕。因此，BALF中生物標志物的檢測可能為肺癌的診斷提供重要的信息，尤其是在早期階段。

此次試驗仍存在一些不足，試驗對照組很難從健康個體中獲得BALF樣本，因此選取了患有肺部良性疾病的患者。另外，這兩個基因的甲基化變化是否與肺癌患者的預后相關還不清楚。可進一步對SHOX2和RASSF1A基因未甲基化的肺癌患者預后進行評價。因此，BALF中SHOX2和RASSF1A的甲基化分析在肺癌診斷中具有高效的診斷能力，尤其是在早期。它有可能成為一種有前途的肺癌診斷生物標志物，并在肺癌診斷中作為細胞學的輔助工具。