原代肝細胞培養與動物實驗對比研究維生素A缺乏對貧血的影響

藍嵐 鄒培斧 梁克紀

摘?要：目的：通過原代大鼠肝細胞培養和動物實驗模型的對比來研究維生素A對貧血的影響。方法：將SD大鼠按體重隨機分為4組，每組13只，分別為Fe+維生素A（Ⅰ組）、Fe+維生素A（Ⅱ組）、Fe+維生素A（Ⅲ組）、Fe+維生素A（Ⅳ組）。實驗動物喂養10周后處死并分離肝臟;原代大鼠肝細胞按Seglent二步消化法分離后，分為嚴重缺乏組（A）、邊緣缺乏組（B）、正常組（C）、治療組（D），依次給予0、0.5、1.0、50 μmol/L 的視黃酸（全反式）培養96 h。用Western-Blot法測量轉鐵蛋白受體（TFR）、用ELISA方法測量鐵蛋白（Fn）蛋白的表達，逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR法）檢測肝TFR mRNA、Fn mRNA的表達。結果：當維生素A缺乏時，大鼠肝TFR mRNA表達上調，使TFR蛋白增加，而Fn mRNA表達下調，Fn蛋白表達下降，差異具有統計學意義（P<0.05）。結論：維生素A補給可顯著減輕鐵缺乏造成的利用障礙干擾。

關鍵詞：維生素A 缺乏;貧血;轉鐵蛋白受體;鐵蛋白

大量臨床觀察研究和研究均證實，維生素A缺乏與鐵代謝有關，補給維生素A有利于糾正貧血，但對兩者的相互作用原理，特別是維生素A干擾鐵代謝的機制和基礎還沒有闡明[1]。鐵蛋白（Fn）、轉鐵蛋白受體（TFR）作為細胞鐵代謝核心調節物，維持鐵的內環境穩態上位于非常重要的位置。這種核心調控作用受到國內外研究者的廣泛關注[2]。作為一種轉錄輔助因子，維生素A能夠調節儲存器官（肝臟）Fn、轉鐵蛋白受體mRNA水平，從而影響鐵利用。本研究通過大鼠動物實驗和原代肝細胞的培養技術來研究維生素A，為維生素A缺乏加劇貧血提供科學依據。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

Ⅳ型膠原酶、Ⅰ型膠原、DMEM培養基，均購于公司Gibco BRL，USA;PCR試劑TaKaRa Taq DNA Polymerase Kit，購自大連寶生物工程公司;引物為美國Promega公司、海英駿生物技術有限公司提供等。

1.2?動物實驗模型

SD大鼠21日齡52只，首先按隨機分組的方法，分為4組后在動物室適應喂養1周，按體重隨機分組，每組13只。Ⅰ組：35 mg/kg（Fe）+ 1 200 μg/kg（維生素A）;Ⅱ組：35 mg/kg（Fe）+0 μg/kg（維生素A）;Ⅲ組：35 mg/kg（Fe）+ 120 μg/kg（維生素A）;Ⅳ組：15 mg/kg（Fe）+ 120 μg/kg（維生素A）飼料。單籠喂養10周處死，分離肝臟備用[3]。

1.3?大鼠體外實驗

參照Seglent法[4]消化分離原代肝細胞，將大于90%活力的新鮮分離的肝細胞接種在I型膠原培養板內，經過24 h培養后，隨機分為：維生素A完全缺乏組（A）：培養液中0.5%DMSO+0%atRA;維生素A邊緣缺乏組（B）：0.5%DMSO+0.5 μmol/L atRA;維生素A正常對照組（C）：1 μmol/L atRA;維生素A治療組（D組）：培養液中0.5%DMSO+50 μmol/L atRA。培養96 h后離心收集肝細胞凍存。用Western-Blot法檢測TFR的蛋白水平，用ELISA方法測量Fn的蛋白水平。

1.4?引物

內參照（β-actin）、TFR、Fn引物核酸序列為TFR：ACATGGACAGGAATACGTTC（上游5’→3’）;CAATC-GG ATGCTTTACGTCC（下游5’→3’），Fn：GTCTCCCTCGCAAGTGCGCC（上游5’→3’）;下游：TGCATTCAGCCCGCTCTCCC（5’→3’），β-actin：GTGATGGTGGGAATGGGTCAG（上游5’→3’）;TTTGATGTCACGCACGATTTCC（下游5’→3’）;分子量依次為708、250、512。94 ℃預變性4 min，變性30 s，退火為55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 50 s，各指標35個循環。再保持72 ℃ 10 min，4 ℃冰箱儲存[5]。PCR產物跑2%瓊脂糖凝膠電泳，掃描結果。

1.5?數據處理

經過SPSS 16.0統計軟件，結果以±s表示，采用重復測量資料的方差分析比較多組間區別，組間的差別比較采用SNK-q檢驗，以α=0.05作為檢驗標準。

2?結果與分析

2.1?動物實驗結果

Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組結果比較，TFR mRNA表達上調，Ⅰ組TFR mRNA的表達最少，Fn mRNA的表達趨勢相反（P<0.05）（圖1～7）。

2.2?原代肝細胞培養

隨著維生素A劑量的增加，TFR mRNA表達下調，TFR蛋白也隨之下降，Fn mRNA表達上調，蛋白水平也隨之上調（P<0.05）。反之，在肝細胞維生素A缺乏時，TFR mRNA在肝臟表達上調，而Fn mRNA表達下降，提示在維生素A缺乏時機體通過影響大鼠鐵代謝蛋白的轉錄水平的表達，使作為儲存器官的肝細胞從血中攝取鐵增加，釋放減少，導致利用障礙，從而導致貧血的發生。當補充維生素A可緩解這種改變，肝臟的TFR mRNA表達減少，而Fn mRNA增加，使TFR蛋白表達減少，Fn蛋白表達增加，使貧血得到緩解（附表）。

3?討論

大量流行病學、臨床觀察實驗顯示，維生素A缺乏可影響貧血，特別在婦幼人群更為突出[5-7]。維生素A缺乏加劇貧血的主要機制可能與鐵代謝的調節有關[8]。細胞鐵穩態主要受幾種核心調節蛋白所調控，這些蛋白主要是主導細胞攝取的TFR，完成貯存的Fn和鐵調節蛋白（IRP），這些蛋白的表達情況直接影響到細胞鐵穩態的維持，它們共同調控鐵在細胞內的利用，確保在骨髓細胞需要時有鐵供給，同時避免鐵毒性[9-13]。

本研究表明，大鼠維生素A缺乏時，TFR升高，但肝臟Fn降低——這種作用導致肝細胞對鐵的儲存增加，釋放入血減少，從而骨髓利用降低，使貧血加劇。大鼠原代肝細胞培養技術是保留了肝細胞自身功能又能排除體內實驗的干擾的實驗技術，但實驗中有容易被污染和肝細胞分離后難以貼壁的困難，實驗中要注意實驗動物消毒、無菌操作。原代肝細胞培養時，補充維生素A后這種貧血得以緩解、糾正，但不足之處是維生素A是否影響IRP的活性或通過其他通路還需要進一步研究。本研究對于制定營養干預措施、研制藥物復合制劑防治維生素A和鐵具有指導意義。

參考文獻

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