納豆激酶在血管性疾病防治中的研究進展

劉玉猛 劉英華

摘?要：綜述了納豆激酶的生化特性、防治心血管疾病的功效及應用前景，重點闡述了納豆激酶在心血管疾病方面的藥理作用，表明納豆激酶可以作為預防和治療血管性疾病的膳食補充劑，其作為藥品的開發前景廣闊。

關鍵詞：納豆激酶;血管性疾病;溶栓

對于血栓栓塞性疾病，目前臨床上主要是溶栓治療，常用的一些溶栓藥物為鏈激酶、尿激酶、組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）等，但這些藥物均不同程度存在副作用大、毒性強、半衰期短、使用不便、價格昂貴等不足。近年來研究發現，納豆激酶（NK）作為食品或膳食補充劑，具有強烈的溶栓活性，且安全性較高，可作為一種新型溶栓劑研究和開發。本文綜述NK的生化特征、在血管性疾病中的功效及應用的研究進展。

1?納豆激酶的生化特性

NK是一種堿性絲氨酸蛋白酶。20世紀80年代日本學者Sumi首次發現，納豆發酵過程中形成的納豆菌絲提取物對人工血栓具有溶解作用，并確定其為納豆芽孢桿菌分泌的一種酶，命名為NK[1]。NK氨基酸序列與其他枯草桿菌蛋白酶高度同源，且具有底物專一性，對血漿纖溶酶底物S-2251（H-D-Val-Leu-Lys-PNA）最為敏感，對凝血酶底物S-2238（H-d-Phe-Pie-Pip-Arg-pNA）和激肽釋放酶底物S-2302（H-D-Pro-Phe-Arg-pNA）也有一定活性，而對于尿激酶底物S-2444（pyro-Glu-Gly-ArgPNA）和彈性蛋白酶底物S-2484（pyro-Glu-Pro-Val-PNA）沒有作用，由此可見NK在水解蛋白質上具有特異性[2]。

影響NK穩定性的因素很多，包括溫度、pH、金屬離子和有機化合物等。NK在45 ℃時活性較為穩定，高于45 ℃活性明顯下降，55 ℃時活性完全喪失;NK活性幾乎不受低溫影響，反復凍融5個循環以后，酶活性仍能保持95%以上。pH值在6.0～9.0之間NK較為穩定，低于5.0時穩定性較差，其最適pH為7.0[3]。目前已經可以通過基因工程技術改善NK的熱穩定性和pH值耐受性，通過點突變技術獲得的重組NK雙突變體Q59E/N218D熱穩定性明顯提高，酶活性保持不變;用酸性或堿性氨基酸替換納豆激酶Ser182和Leu203位點則可以改變重組NK的最適pH值，使其在酸性范圍或堿性范圍內保持穩定。NK的活性不受5 mmol/L Cys的影響，乙二胺四乙酸（EDTA）對其有輕微的抑制作用，而蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）能完全抑制其活性[4-5]。金屬離子對于NK活性影響各異：Mn2+和Ca2+具有明顯NK激活作用，金屬離子Hg2+和Cu2+可使其完全失活，Zn2+和Al3+對NK有一定抑制作用，K+和Fe2+則對NK無明顯影響[6]。

2?納豆激酶防治血管性疾病的功效

2.1?預防血栓形成及溶栓作用

機體內纖溶系統功能降低是血栓形成的重要原因之一，而血液的纖溶能力主要取決于血漿t-PA及纖溶酶原激活劑抑制因子-1（PAI-1）的活性[7]。研究發現，NK可以從多方面發揮預防血栓及溶栓作用。

2.1.1?NK具有較強的纖維蛋白溶解活性?NK溶栓的效果要遠大于纖溶酶和彈性蛋白酶，活性是纖溶酶的4倍。NK能夠水解纖維蛋白成多肽和氨基酸，體外實驗證明，把NK提取液加到纖維蛋白平板上時，隨即出現透明溶解環，溶解環的大小和酶的活性正相關，溶栓效果顯著[8]。動物實驗表明，NK在體內發生纖溶作用時，不用通過激活纖溶酶原，而是直接水解交聯纖維蛋白。其對交聯纖維蛋白水解活性很強，對纖維蛋白原不敏感，即不會水解血漿中的纖維蛋白原而造成出血傾向。

2.1.2?NK能激活其他纖溶酶尿激酶原和t-PA等?NK能激活尿激酶原使之轉變為尿激酶，間接增強內源性纖溶酶量及活性[9]，作用機理可能為：（1）刺激血管內皮細胞產生t-PA，t-PA將纖溶酶原激活為纖溶酶，溶解纖維蛋白、降解血栓[10];（2）激活體內的尿激酶原轉化為尿激酶，尿激酶與t-PA共同激活纖溶酶原，發揮溶栓效果;（3）降解和失活纖溶酶原激活物抑制劑PAI-1，間接增加尿激酶和t-PA的量，促進血纖維蛋白的溶解。

2.1.3?NK具有一定的抗血小板聚集作用?有研究通過觀察NK對急性血瘀模型大鼠血液流變學和血小板聚集的影響，發現其能明顯降低血瘀大鼠的全血粘度、血漿粘度、紅細胞聚集指數等血液流變學指標水平，同時由ADP、凝血酶、花生四烯酸誘導的血小板聚集也被明顯抑制[11]。人血小板Ca2+動員的體外實驗表明，其抗血小板聚集作用的機制可能在于NK可以顯著提高血小板環磷酸腺苷（cAMP）水平，抑制血小板活化[12]。

2.1.4?NK通過抗炎及抗氧化應激防止血栓形成的加速動物和細胞實驗表明，NK可以通過抑制脂多糖（LPS）誘導的NADPH氧化酶2（NOX2）和Toll樣受體4（TLR4）活化，顯著抑制LPS誘導的活性氧（ROS）生成和核因子κB（NF-κB）活化，劑量依賴性地降低LPS誘導的炎癥細胞因子水平，如腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素6（IL-6）等，證實NK具有抗炎和抗氧化功效，而越來越多證據顯示，炎癥、氧化應激和凝血之間有強烈的相互作用，NK通過抑制炎癥和氧化應激有效保護了小鼠免受LPS誘導的急性腎損傷和腎小球血栓的侵害，證實NK可以通過打破炎癥、氧化應激和血栓形成之間的惡性循環，發揮抗血栓的作用[13]。

2.2?抗凝血作用

動物實驗證實，NK可以通過阻斷內、外源性凝血途徑從而抑制凝血活酶的形成，延長凝血活酶時間，并且其在凝血第二階段能夠明顯延長纖維蛋白凝固時間，在凝血的第三階段明顯延長凝血酶時間[14]，意味著NK對整個凝血過程都有一定抑制作用。相關人群研究也證實，NK在抗凝血方面的特殊功效。在一項人群實驗中，每天給予3組受試者（健康志愿者、有心血管危險因素患者、透析治療患者）2粒NK膠囊（2 000 FU/粒），2個月后發現所有組中凝血因子Ⅶ、Ⅷ及纖維蛋白原均顯著下降，并且受試者未出現任何不良反應[15]。在另一項包含12例健康男性受試者的雙盲隨機對照研究中也得出相似的結論，受試者接受單劑量的NSK-SD 2 000 FU或安慰劑，發現2、4 h時NK受試者血液中抗凝血酶濃度顯著升高，活化部分凝血活酶時間（APTT）明顯延長，凝血因子Ⅷ活性在4、6 h時下降，6、8 h時該組的D-二聚體濃度也顯著高于對照組，但這些變化均處于正常范圍內，表明NK的抗凝血活性可能涉及多種不同的途徑，而且不會增加出血風險[16]。高膽固醇血癥患者的NK應用研究中也觀察到NK與抗凝血作用之間的顯著關聯，每天給予高膽固醇血癥患者NK膠囊2 000 FU 8周后，相比于安慰劑對照組，NK組血清中凝血酶原時間（PT）和APTT明顯升高，進一步表明NK在各種人群中均有顯著的抗凝血功效[17]。

2.3?改善血脂及抗動脈粥樣硬化作用

血管的粥樣變化與長期血脂異常密切相關，研究發現，NK具有一定的預防和降低血脂作用。動物實驗結果顯示，與高脂對照組相比，每天給予NK 280 FU/kg的動脈粥樣硬化模型大鼠血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、動脈粥樣硬化指數等均顯著下降，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平明顯升高，提示NK具有一定的改善血脂作用[18]。一項NK對頸動脈粥樣硬化和高血脂患者的療效研究中，NK組受試者每天口服NK 6 000 FU，持續服用26周后，其斑塊面積和頸總動脈中膜厚度明顯下降，同時觀察到NK能顯著降低受試者的TG、TC、LDL-C水平，并有提升HDL-C的作用，但其改善血脂作用與動脈粥樣硬化的改善指標沒有正相關關系，表明NK改善動脈粥樣硬化作用可能不是直接通過降低血脂水平實現的，可能與其抗炎、抗氧化和溶栓作用有關[19]。

2.4?抗高血壓作用

NK對高血壓前期患者有一定的降壓作用。在一項北美高血壓人群（收縮壓≥130 mmHg或舒張壓≥90 mmHg）中進行的隨機雙盲安慰劑對照臨床研究中，每天服用NK 100 mg的受試者在8周后，觀察到收縮壓和舒張壓相較于安慰劑組均有降低，而這種降血壓作用對于男性受試者更為顯著[20]。另一項針對亞洲高血壓1期人群的臨床試驗中，NK組（口服NK 2 000 FU/d）收縮壓和舒張壓在干預8周后比對照組平均降低5.55 mmHg和2.84 mmHg[21]。一項針對自發性高血壓大鼠的動物實驗對NK的降壓作用進行了研究，通過比較NK和不具有蛋白酶活性的NK衍生片段，發現NK及其片段通過不同的機制發揮了降壓作用，進食高劑量NK大鼠（2.6 mg/g飲食）收縮壓、舒張壓和血漿纖維蛋白原水平均顯著降低，而NK片段則抑制了腎素、血管緊張素轉化酶的活性以及血管緊張素Ⅱ濃度升高，表明NK可能是通過裂解血漿中纖維蛋白原發揮降血壓的作用，其片段則可能是通過抑制血管緊張素Ⅱ來抑制大鼠的血壓升高[22]。其他相關動物實驗也均得到相似的結論[23-24]，從而表明NK可被開發為預防高血壓和血管性疾病的新型膳食補充劑或功能性食品。

3?納豆激酶在防治血管性疾病的應用前景

3.1?納豆激酶安全性

納豆的食用在日本有上千年的歷史，安全性經得住檢驗，NK的安全性也在很多研究中得到驗證[25-26]?？诜﨨K后，血中優球蛋白溶解時間（ELT）大大降低，優球蛋白纖溶活性增強，血栓溶解面積和分解產物增加。國內學者在小鼠NK的毒性檢測試驗中通過大劑量喂食，結果也并未發現任何致畸現象[27]。動物實驗顯示，NK靜脈注射會對小鼠血管及周圍組織有強烈刺激作用，大劑量注射則會導致小鼠死亡，原因可能與呼吸中樞抑制及出血有關，而經口大劑量服用NK的小鼠并未發現死亡及不良反應。因此，NK的給藥途徑上，口服給藥安全性更高。但另一方面，在血液中NK的最高安全濃度上，仍然需要大量實驗數據來確保臨床應用的安全。

3.2?納豆激酶的應用劑量

目前開發的NK制劑主要以口服為主，包括片劑、軟膠囊、硬膠囊、緩控釋制劑等，國際規定其含量單位為FU/片，國內專家建議NK最大攝入量為2 000～2 800 FU/d，35歲以上人群適宜服用[28]，日本營養健康食品協會規定的每日正常維持量則在2 000 FU以上。另外，如下人群不建議服用NK：（1）嚴重腹瀉、嘔吐、消化不良患者;（2）皮膚、內臟器官出血、滲血者;（3）需要促凝藥物治療的患者;（4）治療中已經使用大量溶栓藥物者;（5）具有出血性疾病遺傳家族史患者;（6）妊娠及哺乳期婦女;（7）支架術后患者遵醫囑執行。

4?展望

血栓性疾病在全球范圍內高發，預防和治療血栓性疾病藥物還具有很大的市場需求，NK在纖溶活性、安全性、成本和持續時間上都有獨特優勢，有望成為治療和預防血栓性疾病的理想藥物。另外，針對當前肆虐全球的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）疫情，柳葉刀等雜志研究結果發現，重型或危重型新冠肺炎患者存在凝血功能異常，病毒感染機體后，攻擊血管內皮細胞，致其損傷并誘發血管內彌漫性凝血，加之患者本身的基礎疾病、激素使用等情況，極易形成血栓，進而導致全身器官衰竭危及生命。即使重癥COVID-19患者經治療恢復后，血管內彌漫存在的血栓同樣會增加其靜脈血栓栓塞癥（VTE）的發生風險，留下長期的后遺癥[29-30]。目前針對重型和危重型COVID-19患者VTE的預防，首推低分子肝素皮下注射的方式，但出血風險也相應增加。因此，鑒于NK突出的溶栓效果和抗出血傾向的特性，將其作為重型和危重型COVID-19患者VTE的輔助防治方案，具有一定的臨床研究價值。同時，對于康復期患者，能否通過口服NK促進其康復，改善其后遺癥狀況，有待進一步研究和探討。

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