超高效液相色譜-串聯質譜在維生素檢驗中的應用

摘要：維生素分為脂溶性維生素和水溶性維生素。目前，其檢驗方法主要有放射免疫分析法、酶聯免疫分析法、化學免疫發光法和超高效液相色譜-串聯質譜法等。其中，免疫檢驗法無法區分其亞型及同分異構體，因此經常會出現假陽性或假陰性。超高效液相色譜-串聯質譜法以檢驗速度快，分辨率高，靈敏度高，特異性高等優點成為標本內小分子檢驗分析的金標準，快速應用于臨床實驗室診斷的多個方向。為減少標本采集量及一次進樣同時檢驗多種維生素提供了檢驗平臺。

關鍵詞：檢驗原理;在維生素檢驗中的應用;局限性

一、超高效液相色譜-串聯質譜法檢驗原理

經預處理的標本進入超高效液相色譜（UPLC）系統，經色譜柱分離、純化和濃縮，被導入質譜儀的離子源。標本在離子源內電離，帶電離子在接口內進行去溶劑，通過Q0聚集、冷卻進入三重四級桿質量分析器，根據離子的質荷比（m/z）進行分離。Q1質量分析器被設定為選擇特定的母離子，母離子在Q2碰撞室碎化、裂解，產生的子離子進入Q3質量分析器進行分離。檢驗器記錄離子的信號，然后將信號傳輸到電腦繪制成圖譜。以穩定同位素內標來校準和消除測量誤差，將標本與相應內標峰面積比代入標準曲線方程計算血清標本中對應維生素含量。具體如下：

二、在維生素檢驗中的應用

維生素分為脂溶性維生素和水溶性維生素。其中，脂溶性維生素包括維生素A、25-羥基維生素D2、25-羥基維生素D3、維生素E、維生素K;水溶性維生素包括維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12以及維生素C。維生素是人體所必需的微量營養成分，是機體酶系統中輔酶的重要組成部分，對新陳代謝起調節作用。一般在體內不能合成或合成量很少，需通過飲食等手段獲得。維生素缺乏或過量均會導致營養性疾病的發生，故提高維生素檢驗準確性、特異性是滿足臨床檢驗診斷需求的必然。

不同維生素具有不同的分子式，化學性質也不盡相同，即使相同維生素，也有不同的分子結構。維生素檢驗從標本預處理到準確檢驗應用方法都存在著不同的技術挑戰。例如酶聯免疫分析法、化學免疫發光法無法區分維生素亞型及同分異構體，易與自身內抗體發生交叉反應，特異性較低，因此經常會出現假陽性或假陰性。而且不同檢驗品牌試劑對不同目標免疫化合物的免疫捕獲率也會存在一定差異，不同檢驗平臺的免疫檢驗方法結果可比性較差。

超高效液相色譜-串聯質譜法以檢驗速度快，分辨率高，靈敏度高，特異性高等優點成為標本內小分子檢驗分析的金標準，快速應用于臨床實驗室診斷的多個方向，逐漸被臨床檢驗醫學專家們所廣泛關注。在歐美國家，超高效液相色譜-串聯質譜法作為檢驗醫學行業協會公認的生物標本內小分子分析的金標準方法，已被其權威檢驗機構廣泛應用于臨床研究及診斷。

以維生素D檢驗為例，人體維生素D主要來源于經陽光和皮膚作用合成的維生素D3，另一種來源是食物中的維生素D2，兩者均需要在肝臟中單羥基化為25-羥基維生素D3（25-OHD3）和25-羥基維生素D2（25-OHD2），然后再經過腎臟兩次羥基化才能轉變為具有生物活性的微量雙羥基代謝產物1，25-（OH）2D，其中25-OHD2和25-OHD3是人體血清中25-羥基維生素D（25-OHD）主要的存在形式。同時人體中還存在25-OHD3的異構體，但目前傳統的免疫檢驗方法無法區分亞型維生素D2、D3及異構體。因此，超高效液相色譜-串聯質譜法對于醫生干預補充維生素D2的人群，嬰幼兒及腎功能異常的患者具有重要意義，還可用于評價免疫法的交叉反應程度。此外，由于維生素具有不同的化學結構，免疫方法學需要不同的抗體及方法，而超高效液相色譜-串聯質譜法是分子水平的檢驗，可以一次進樣同時檢驗多種維生素及其相關活性代謝產物。

一次標本處理且檢驗多種維生素的難點在于各待測物在人體血清中的含量差別較大，如人體血清中維生素A、E的含量較高而維生素K的含量微乎其微，且各維生素的極性差別較大，傳統檢驗方法很難同時滿足對維生素在線性范圍內進行檢驗并滿足其高靈敏度的要求。此外，不同人體血清中的內源性物質對維生素檢驗還存在嚴重的基質效應。先進的超高效液相色譜-串聯質譜法可以實現同時檢驗多種維生素的需求，其優勢在于：預處理方法采用96孔板方法，簡化了實驗步驟、大大縮短了預處理時間，提高了檢驗通量;采用梯度洗脫，在縮短分析時間的同時獲得了較好的去介質及分離效果，一次進樣可同時得到多種維生素檢驗結果。同時在預處理過程中添加內標以消除不同基質標本中內源性物質對待檢物的影響，進而提高檢驗結果的準確性。

三、局限性

專業人才培養是臨床實驗室迎接超高效液相色譜-串聯質譜檢驗時代來臨的基礎。不同于臨床常規檢測.超高效液相色譜-串聯質譜技術專業人才需經過長期培訓、臨床實踐和經驗積累，臨床實驗室應在引入超高效液相色譜-串聯質譜技術前充分重視專業人員的培養工作。目前，國內臨床實驗室缺乏大量有經驗的超高效液相色譜-串聯質譜技術專業人才，這嚴重制約了質譜技術快速轉化至臨床實踐。

我國臨床實驗室對質譜檢驗新項目建立和方法性能評價的經驗相對不足，大多參照國外文獻和少部分國內經驗進行方法學建立、性能評價、設立評估標準和質量管理。這種自我管理模式為內部質量管理和外部標準化帶來巨大挑戰，因此亟待我國相關部門出臺針對質譜相關的臨床實踐指南以規范質譜臨床檢測。

國內不同臨床實驗室間技術水平與能力參差不齊，人員素質和檢驗系統存在一定差異，若放松對質譜技術臨床應用的監督和管理，任其恣意發展，最終帶來的只能是“亂象”，而直接參照美國FDA的監管，則將可能極大阻礙我國質譜技術在臨床實驗室領域的發展。對于我國臨床實驗室現狀而言，質譜技術臨床應用的發展需求遠遠重于監管需求。如何滿足日益增長的臨床需求，鼓勵質譜技術在臨床實驗室中得到科學普及和規范應用則是我們需要考慮的問題。

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作者簡介：

尚麗麗，女，漢族，醫學學士（醫學檢驗專業），13年臨床實驗室工作經驗，主要從事生殖遺傳，優生優育，亞健康評估等方向的檢驗研究工作。