神經性布氏桿菌病樹鼩模型建立及間充質干細胞治療實驗教學初探

[摘 要] 嘗試應用鼻腔灌注法及頸背部注射法建立樹鼩神經性布氏桿菌病模型，通過臨床觀察，以期探索建立一個病理過程、臨床表現與人類疾病相類似的布氏桿菌病動物模型的方法，用于該病的致病機理、藥物篩選評價等實驗研究，為神經性布氏桿菌病的發病機制研究及藥物研發工作提供新的思路。

[關鍵詞] 神經性布氏桿菌病;樹鼩;間充質干細胞;實驗教學

[課題項目] 2019年度河套學院科學研究項目“神經性布氏桿菌病樹鼩模型建立及間充質干細胞治療的實驗研究”（HYZY201940）

[作者簡介] 劉立飛（1986—），內蒙古通遼人，河套學院醫學系講師，主要從事外科護理學、急救醫學、護理管理研究。

[中圖分類號] G642.0 ? ?[文獻標識碼] A ? ?[文章編號] 1674-9324（2020）34-0259-02 ? ?[收稿日期] 2020-02-24

一、神經性布氏桿菌病樹鼩模型建立及間充質干細胞治療實驗教學概述

布氏桿菌病（Brucellosis）又稱為布魯氏菌病，是布氏桿菌感染引起的人畜共患傳染性疾病。布氏桿菌屬的細菌是一組微小的革蘭陰性菌，它可經多種傳播途徑感染人類，隨血液帶至全身，造成菌血癥、毒血癥和敗血癥。在我國，布氏桿菌病和流行性腦膜炎、肺結核、登革熱等傳染病一同列入乙類傳染病。內蒙古自治區作為全國畜牧區，是我國人畜布氏桿菌病疫情最為嚴重的地區之一。

布氏桿菌病臨床表現十分復雜，神經系統病變是其局限性損害的表現。已報道的中樞神經系統病變有腦膜腦炎、腦膜炎、脊髓炎、腦脊髓膜炎、硬腦膜外膿腫、腦膿腫（包括垂體膿腫）、腦梗死、短暫性腦缺血發作、蛛網膜下腔出血、白質腦病、顱內靜脈系統血栓形成及精神異常等。

由于脊柱脊髓損傷的高致殘率，給家庭和社會造成沉重的負擔，傳統的治療主要依靠藥物和外科手術，雖然可在一定程度上緩解，但療效有限，多局限在病癥的緩解，無法從根本上解決病患的問題，因此其治療至今仍然是一個世界性難題。干細胞移植治療脊髓損傷，使損傷軸突再生、突觸重建和恢復脊髓部分功能成為可能，而間充質干細胞，特別是骨髓來源的間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）除了具有干細胞的一般特性外，相比其他類型的干細胞，還具有取材方便、不涉及倫理問題、易于外源基因轉染及穩定表達、免疫原性弱、可進行自體移植、尚未發現致瘤性等諸多優點，在醫學上被認為是一種細胞替代治療及基因治療的理想靶細胞，尤其是在神經系統損傷修復領域，有著良好的應用前景。

二、神經性布氏桿菌病樹鼩模型建立及間充質干細胞治療實驗教學方法

（一）建立樹鼩神經性布氏桿菌病模型

1.布魯氏桿菌培養及菌液制作。實驗分組和模型制備。

2.檢測指標。（1）行為學檢查;（2）磁共振成像檢查;（3）病原學檢查;（4）組織病理學檢查。

3.統計分析和模型評價。

（二）樹鼩星形細胞與少突膠質細胞的體外原代培養及其在布氏桿菌感染作用下炎癥因子早期的變化研究

細胞培養：體外分離培養樹鼩角膜星形細胞與少突膠質細胞。（1）初步感染：實驗組細胞分別接受107、108和109CFU/ml三種濃度的菌懸液感染，分別吸取不同濃度的菌懸液20ul，滴加于實驗細胞培養液中;對照組滴入20ul磷酸鹽緩沖液（PBS）。（2）檢測指標：在感染操作后12h、1、3、5分批使用Trizol法提取細胞總RNA，用于RT-PCR實驗，檢測實驗細胞中TNF-α、IL-12、IL-8、IL-1β、IL-6的蛋白表達。

（三）樹鼩間充質干細胞體外分離培養

（四）間充質干細胞治療樹鼩神經性布氏桿菌病脊髓損傷的神經系統變化研究

1.實驗分組：選取樹鼩20只，隨機分為模型組、生理鹽水組。

2.實驗方法：選取行為學表現較差、且磁共振成像脊柱損傷的實驗動物，經靜脈途徑將體外分離培養后的BMSCs注射入體內，對實驗動物進行行為學觀察并評估，且注射后定期對實驗動物脊柱進行磁共振成像檢查。

3.檢測指標：在手術操作后定期分批處死動物。采集腦組織、脊髓標本，用于RT-PCR實驗，檢測實驗動物腦組織及脊髓中的炎癥因子表達變化TNF-α、IL-12、IL-8、IL-1β、IL-6的表達變化情況。接種后5、10、15、20和30d應用過量麻醉法分批處死實驗動物，取實驗動物腦組織及脊柱進行HE染色觀察病理改變，PAS染色觀察神經系統組織間的細菌菌灶，透射電鏡觀察角膜超微結構改變。對間充質干細胞治療結果做簡單評估。

三、研究與討論

由于神經性布氏桿菌病是一種嚴重致癱性疾病，我國神經性布氏桿菌病患者中綿羊和山羊種（B.melitensis），是最常見的致病病原菌，臨床早期正確診斷和治療存在一定困難，治療后存在感染復發的可能性。我區農牧業人口居多，牧區面積大，布氏桿菌病患者很常見。對于布氏桿菌病來說，尋找一種低成本、再現性好、復制率高的理想動物模型有利于推動該疾病的相關研究。

目前常用作實驗動物的小鼠和兔神經系統與人類神經系統存在差異，不利于重現人類神經性布病的臨床表現。樹鼩隸屬于攀鼩目樹鼩科樹鼩屬，為外形類似于松鼠的一類小型哺乳類動物，體型較小，體重≤320g，廣泛分布于東南亞、南亞及我國南部。樹鼩比較容易飼養管理，繁殖快，價格低廉，其新陳代謝較鼠類和犬類等動物更接近于人，大體解剖也近似于人。最近，昆明動物研究所組織了中緬樹鼩全基因組測定和解析工作，得到了高覆蓋度（79X）的基因組序列。通過基因組分析，發現樹鼩在神經及免疫系統等方面與人類具有較為高度的同源性，在很多方面具有可用來替代獼猴等大型靈長類實驗動物的遺傳基礎，可能還適合于更多的免疫學、神經生物學及代謝等生物學問題和疾病機理研究（Fan et al，2012）。

本研究通過臨床觀察、磁共振成像檢查、組織病理學檢查、病原學檢查、透射電鏡超微結構觀察等對造模的成功率、與人類疾病的相似程度進行評價，檢測感染過程中相關的炎性因子的變化，探索建立一個病理過程、臨床表現與人類疾病相類似、價格低廉、技術簡單、成功率較高的布氏桿菌病動物模型的方法，用于該病的致病機理、藥物篩選評價等實驗研究，在感染后期進行初步探討甘露糖受體（MR）和Dectin-1在神經性布病的發生發展中的作用，為神經性布病的發病機制研究及藥物研發工作提供新的思路。

參考文獻

[1]李振宇，陳玲霞，尹博文，等.骨髓間充質干細胞向肝樣細胞分化的研究進展[J].實驗動物科學，2015，32（3）：56-61.

[2]黃霞，潘興華，龐榮清，等.樹鼩2型糖尿病模型的構建及其相關因素分析[J].西南國防醫藥，2015，25（8）：834-837.