PTEN/PI3K/AKT通路緩解糖尿病視網(wǎng)膜病變的機(jī)制

楊麗娜 方肖云

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 312500)

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病最為嚴(yán)重、常見(jiàn)且對(duì)視力功能有嚴(yán)重影響的眼部并發(fā)癥，是糖尿病患者致盲的主要原因之一〔1〕。視網(wǎng)膜病變后視神經(jīng)元凋亡是導(dǎo)致患者視功能不佳甚至失明的主要原因，故找到一種抑制視網(wǎng)膜病變后光感受器細(xì)胞凋亡的方法，對(duì)改善糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的視功能及降低失明風(fēng)險(xiǎn)意義重大〔2，3〕。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育期的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞中有第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因(PTEN)優(yōu)先定位〔4〕。PTEN參與神經(jīng)元凋亡的過(guò)程，作為一種主要的神經(jīng)元凋亡調(diào)節(jié)因素，PTEN具有蛋白磷酸酶與脂質(zhì)磷酸酶雙重活性，作為脂質(zhì)磷酸酶時(shí)，可對(duì)磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(AKT)信號(hào)通路產(chǎn)生負(fù)性調(diào)控，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，加速細(xì)胞凋亡〔5〕。Sun等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)，將成年小鼠視網(wǎng)膜上PTEN基因敲除后，視神經(jīng)損傷，但視網(wǎng)膜神經(jīng)元活性增加，認(rèn)為PTEN的失活是提高皮質(zhì)神經(jīng)元再生能力的主要原因。故推測(cè)抑制PTEN影響PI3K/AKT信號(hào)通路可能對(duì)緩解糖尿病視網(wǎng)膜病變有一定價(jià)值，但目前與之相關(guān)的研究并不多見(jiàn)。本研究探討PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路緩解糖尿病視網(wǎng)膜病變的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的50只SD大鼠，許可證號(hào)：SCXK(甘)2019-0001。大鼠周齡均為8 w，雌性25只，雄性25只，雌性與雄性分籠喂養(yǎng)；體重0.20～0.22〔平均(0.21±0.01)〕kg。

1.2主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備與試劑 北京博愛(ài)科貿(mào)生物有限公司提供的鏈脲佐菌素、上海派普泰克生物制劑有限公司提供的內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、美國(guó)Sigma公司提供的雙過(guò)氧釩(bpV，PTEN特異性抑制劑)、美國(guó)Roche公司提供的TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、上海華靈康復(fù)器械廠(chǎng)提供的高效切片石蠟、上海化學(xué)試劑公司提供的各類(lèi)化學(xué)試劑，如多聚甲醛、二甲苯等、日本Olympus公司提供的熒光顯微鏡、光學(xué)顯微鏡，美國(guó)Cell Signaling公司提供的兔抗大鼠AKT單克隆抗體、p-AKT單克隆抗體，美國(guó)Abcam公司提供的兔抗大鼠B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2多克隆抗體、胞質(zhì)細(xì)胞色素(Cyt)C多克隆抗體、磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)依賴(lài)性激酶(p-PDK)1多克隆抗體、鼠抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3單克隆抗體及胞質(zhì)蛋白制備試劑盒，其他細(xì)胞裂解液、蛋白濃度檢測(cè)試劑盒等均由碧云天生物試劑提供。

1.3方法

1.3.1分組方法 SD大鼠50只，隨機(jī)抽取10只作為空白對(duì)照組，其余40只作為模型組建立糖尿病視網(wǎng)膜病變模型，視網(wǎng)膜病變大鼠模型均為增殖期。建模后隨機(jī)抽取10只大鼠納入安慰劑組，為其視網(wǎng)膜下注射安慰劑，其他30只大鼠視網(wǎng)膜下注射bpV隨機(jī)分為3組，bpV使用劑量分別為40 ng/kg、400 ng/kg、4 000 ng/kg。每組10只大鼠，動(dòng)物的使用均符合視覺(jué)與眼科研究協(xié)會(huì)2014年年會(huì)提出的有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的相關(guān)條款〔7〕。全部大鼠在12 h白晝/12 h夜晚的環(huán)境下喂養(yǎng)，環(huán)境濕度55%～60%，溫度：22～25℃。

1.3.2糖尿病視網(wǎng)膜病變建模方法 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，模型組腹腔內(nèi)注射60 mg/kg鏈脲佐菌素液，注射前禁食16 h，不禁水，注射3 d后檢測(cè)空腹血糖值，若≥16.7 mmol/L則判定為糖尿病；在成功建立糖尿病模型后，使用微量進(jìn)樣器抽取內(nèi)皮生長(zhǎng)因子0.05 μg，于大鼠顳側(cè)角膜后緣2 mm水平處經(jīng)睫狀體平坦部位向玻璃體腔內(nèi)注射，進(jìn)樣器緩慢推進(jìn)并留針10 s，28 d后分批對(duì)模型組進(jìn)行眼底熒光造影檢查，若造影結(jié)果顯示血管擴(kuò)張迂曲、背景熒光增強(qiáng)、新生血管熒光滲漏等影像學(xué)表現(xiàn)則視作發(fā)生糖尿病視網(wǎng)膜病變，且病變階段為增殖期，成功建立糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型。

1.3.3模型組分組與給藥方法 全部建模成功的40只大鼠中隨機(jī)抽取10只納入安慰劑組，在成功建模第4天為其視網(wǎng)膜注射安慰劑，其他30只大鼠均在視網(wǎng)膜下注射bpV，隨機(jī)分為3組，劑量分別為40 ng/kg、400 ng/kg、4 000 ng/kg。

1.4相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

1.4.1制備組織切片 模型制作后3 d，使用1%戊巴比妥鈉向大鼠腹腔注射，處死大鼠，大鼠的處理符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部“關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指導(dǎo)性意見(jiàn)”中的相關(guān)意見(jiàn)〔8〕。大鼠處死后在角膜12點(diǎn)位置處做好標(biāo)記，并保留角膜緣球結(jié)膜，將其他部位球結(jié)膜去除，摘取眼球后放置在眼球固定液中，行脫水、包埋、視神經(jīng)矢狀切片等處理，切片厚度約為5 μm，用于免疫熒光染色操作。將分離得到的視網(wǎng)膜置于液氮內(nèi)保存，進(jìn)行Western印跡檢測(cè)。標(biāo)本進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋等操作。

1.4.2主要檢測(cè)指標(biāo)與方法 結(jié)合免疫熒光與Western印跡法檢測(cè)PTEN在建模后1 d、2 d、3 d、7 d的表達(dá)，同時(shí)使用熒光凋亡試劑盒檢測(cè)視神經(jīng)細(xì)胞元凋亡情況，嚴(yán)格按照試劑盒進(jìn)行操作與判別。①免疫熒光檢測(cè)p-AKT、p-BAD、Bcl-2：大鼠雙眼球摘取后石蠟切片常規(guī)脫蠟，切片微波抗原修復(fù)，緩沖液沖洗，山羊血清內(nèi)封閉，緩沖液沖洗，稀釋孵育過(guò)夜，緩沖液沖洗孵育后過(guò)夜，復(fù)染后再次沖洗，脫水操作后進(jìn)行透明、封片，在熒光顯微鏡下觀察復(fù)染結(jié)果。②Western印跡檢測(cè)視網(wǎng)膜p-PDK1、CytC、Caspase-3蛋白水平：配制組織裂解液、緩沖液，提取組織總蛋白，分離線(xiàn)粒體與胞質(zhì)，配制所需液體后進(jìn)行各項(xiàng)操作，使用軟件檢測(cè)Western條帶灰度值，計(jì)算各蛋白內(nèi)參β-actin灰度比值。③胞質(zhì)處理后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定PIP3表達(dá)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn)、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠建模后各時(shí)點(diǎn)PTEN表達(dá)水平 空白對(duì)照組大鼠PTEN表達(dá)水平為0.39±0.02，模型組建模后PTEN表達(dá)逐漸上調(diào)，建模后1、2 d分別為0.69±0.10，0.81±0.12，在建模后3 d達(dá)到峰值，為0.92±0.04，后呈下降趨勢(shì)，并在7 d(0.44±0.04)恢復(fù)至正常(F=232.456，P<0.001)。

2.2視神經(jīng)元凋亡情況 空白對(duì)照組未檢出視神經(jīng)元凋亡。建模后第1天，在模型大鼠外核層(ONL)發(fā)現(xiàn)少量凋亡細(xì)胞；第2天、第3天模型組大鼠ONL可見(jiàn)視神經(jīng)元凋亡增加，表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)；在建模成功第4天給予大鼠視網(wǎng)膜bpV注射，建模第7天即bpV注射3 d，此時(shí)可見(jiàn)有視神經(jīng)元凋亡數(shù)量減少，表達(dá)強(qiáng)度明顯降低，見(jiàn)圖1。

圖1 各組視神經(jīng)元凋亡情況(TUNEL，×100)

2.3各組p-AKT、p-BAD、Bcl-2、p-PDK1、CytC、Caspase-3表達(dá)比較 與空白對(duì)照組比較，安慰劑組、p-AKT、p-BAD、Bcl-2、p-PDK1、CytC及Caspase-3均明顯降低(P<0.05)。與安慰劑組比較，bpV組p-AKT、p-PDK1、p-BAD、Bcl-2表達(dá)顯著升高，胞質(zhì)CytC、Caspase-3表達(dá)顯著上調(diào)，且bpV 4 000 ng/kg組>bpV 400 ng/kg組>bpV 40 ng/kg組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組p-AKT、p-BAD、Bcl-2、p-PDK1、CytC、Caspase-3相對(duì)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果比較

3 討 論

糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)極為復(fù)雜的病理過(guò)程，引起這種病變發(fā)生的病理原因涉及信號(hào)傳導(dǎo)代謝酶、細(xì)胞因子、炎癥反應(yīng)、離子通道等諸多基因異常改變〔9〕。新生血管形成是糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)入增殖期的主要病理特征，故阻斷新生血管的形成是目前糖尿病視網(wǎng)膜病變治療的主要研究靶點(diǎn)〔10〕。

PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞中廣泛存在，主要作用是通過(guò)參與細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)與分化調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)，該信號(hào)通路在激活的狀態(tài)下可加速內(nèi)皮細(xì)胞存活周期，同血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞的遷移、存活、誘導(dǎo)新生血管形成，是一種促存活信號(hào)通路〔11〕。AKT是絲氨酸抗凋亡主要信號(hào)，可以通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞周期來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白水解并幫助其在細(xì)胞內(nèi)定位，達(dá)到干擾G1期向S期過(guò)渡的目的，發(fā)揮調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖及血管新生誘導(dǎo)之效〔12〕。而PI3K被激活后，則主要受其第二信使PIP3刺激，產(chǎn)生下游更多信號(hào)分子，增強(qiáng)信號(hào)通路傳導(dǎo)，進(jìn)一步增強(qiáng)PI3K通路在內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、血管生成等病理改變中的作用〔13〕。周賽君等〔14〕研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，因高糖導(dǎo)致的缺氧缺血環(huán)境會(huì)激活內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路中AKT表達(dá)，增加其磷酸化，進(jìn)而加速新生血管的形成。這種PI3K/AKT信號(hào)通路傳導(dǎo)信號(hào)增強(qiáng)的機(jī)制，被認(rèn)為可用于指導(dǎo)糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療〔15〕。神經(jīng)元凋亡是諸多神經(jīng)疾病包括視網(wǎng)膜病變?cè)趦?nèi)的最終結(jié)局，可見(jiàn)抑制視神經(jīng)元凋亡對(duì)緩解糖尿病視網(wǎng)膜病變患者病情與抑制病情進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵意義〔16〕。PTEN是一個(gè)高度保守基因，在人與諸多哺乳動(dòng)物中，其具有高度的同源性，可見(jiàn)PTEN在細(xì)胞生命中的關(guān)鍵作用〔17〕；PTEN作為一種脂質(zhì)磷酸酶，可對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路產(chǎn)生負(fù)性調(diào)控，這種負(fù)性調(diào)控對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，參與細(xì)胞凋亡〔18〕。

本研究結(jié)果提示PTEN表達(dá)增加可能介導(dǎo)了糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，可能是視網(wǎng)膜病變大鼠視功能逐漸減退的原因。故考慮抑制PTEN表達(dá)，可能對(duì)減輕視神經(jīng)細(xì)胞凋亡、緩解疾病進(jìn)一步進(jìn)展有積極意義。結(jié)果表明抑制PTEN通路對(duì)阻礙糖尿病視網(wǎng)膜病變視神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有一定應(yīng)用價(jià)值。糖尿病視網(wǎng)膜病變后抑制PTEN能夠重新對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路活性產(chǎn)生直接激活的效果，增加p-BAD、Bcl-2等表達(dá)，發(fā)揮理想的視神經(jīng)保護(hù)之效。