miR-299-5p靶向RRS1調控胃癌細胞增殖、凋亡的分子機制

郭令飛 羅德紅 葛華 王燦

(遵義市第一人民醫(yī)院 1胃腸外科，貴州 遵義 563000；2腫瘤科)

從分子水平探究胃癌發(fā)生進展過程相關的作用靶點對提高治療效果及改善患者預后均具有重要臨床意義〔1〕。研究顯示微小RNA(miRNA)可參與腫瘤細胞增殖、分化及凋亡等生物學過程〔2〕。miRNA-299-5p在甲狀腺癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤中呈低表達，上調miRNA-299-5p表達后可抑制腫瘤細胞遷移及侵襲〔3,4〕。通過靶基因預測軟件預測核糖體合成調控因子(RRS)1是miRNA-299-5p的靶基因，RRS1廣泛分布于真核細胞且屬于一種細胞核蛋白，同時可促進機體內蛋白質分泌及核糖體合成等生理過程〔5〕。相關研究報道，敲低RRS1基因后，核糖體蛋白RPL11釋放量增加且與E3泛素連接酶(MDM)2結合進而促進p53蛋白合成最終促使腫瘤細胞凋亡〔6〕。但miRNA-299-5p與RRS1在胃癌中作用的研究相對較少，本研究擬分析miRNA-299-5p對胃癌細胞增殖及凋亡的影響及其可能作用機制，并證實miRNA-299-5p與RRS1的靶向關系。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 胃癌細胞株BGC-823、MKN45、MGC803與正常胃上皮細胞株GES-1均購自中國科學院上海細胞庫。LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；miR-299-5p mimic及其陰性轉染質粒均購自廣州銳博生物技術有限公司；RRS1過表達質粒(pcDNA-RRS1)、對照質粒(pcDNA)、野生型及突變型RRS1基因3′UTR熒光素酶表達載體均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；RRS1 siRNA(si-WWOX)與陰性對照siRNA(si-NC)均購自美國Santa Cruz公司；miR-299-5p抑制劑(anti-miR-299-5p)與anti-miR-NC均購自上海賓智生物科技有限公司；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；RRS1抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG二抗均購自美國CST公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)細胞增殖分析試劑盒購自美國Sigma公司；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)細胞凋亡試劑盒購自北京博爾邁生物技術有限公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自碧云天生物技術研究所；SYBR Green熒光染料試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)、轉染及分組 人胃癌細胞株BGC-823、MKN45、MGC803與正常胃上皮細胞株GES-1均采用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)，放入恒溫培養(yǎng)箱，每隔2 d更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)3～5 d后進行傳代培養(yǎng)。收集細胞，胰酶消化后接種至6孔細胞培養(yǎng)板，待細胞生長融合至50%～60%時更換不含胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后進行轉染。實驗分為陰性對照組(miR-NC)與miR-299-5p組，其中miR-NC組將miR-NC質粒轉染至BGC-823細胞；miR-299-5p組將miR-299-5p mimic轉染至BGC-823細胞，轉染后6 h更換為正常RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，收集對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。將miR-NC質粒與si-RRS1轉染至BGC-823細胞分別作為miR-NC組、si-RRS1組，轉染及處理方法同上。為了證實miR-299-5p是通過抑制RRS1表達調控BGC-823細胞增殖及凋亡，將miR-299-5p mimic與pcDNA-RRS1共同轉染至BGC-823細胞，檢測RRS1是否可逆轉miR-299-5p抑制細胞增殖及促進凋亡的作用，后續(xù)實驗將分為miR-299-5p+pcDNA組、miR-299-5p+pcDNA-RRS1組，轉染及處理方法同上。

1.3qRT-PCR檢測細胞中miR-299-5p及RRS1 mRNA表達 根據(jù)Trizol試劑說明書提取各組BGC-823細胞總RNA，采用逆轉錄試劑盒將RNA合成cDNA，以cDNA為模板并參照SYBR Green熒光染料試劑盒進行qRT-PCR，循環(huán)反應40次，循環(huán)條件為：95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s。miR-299-5p以U6為內參基因，RRS1以GAPDH為內參基因，收集并分析數(shù)據(jù)Ct值，采用2-ΔΔCt計算miR-299-5p、RRS1 mRNA相對表達量。

1.4Western印跡檢測細胞中RRS1蛋白表達水平 收集各組BGC-823細胞，置于冰上加入RIPA蛋白裂解液提取細胞總蛋白，BCA定量，各組蛋白(樣品量60 μg)均進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將已分離蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶封閉，90 min后加入RRS1(1∶500)蛋白一抗，Tis-HCI緩沖液(TBST)清洗3次，5 min/次，加入二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，TBST沖洗3次，10 min/次，增強型化學發(fā)光試劑(ECL)顯影，置于凝膠成像系統(tǒng)觀察各條帶并應用Image J軟件分析條帶灰度值。每組實驗重復3次。

1.5MTT檢測細胞增殖活力 分別收集miR-NC組、miR-299-5p組、miR-299-5p+pcDNA組、miR-299-5p+pcDNA-RRS1組、si-NC組、si-RRS1組對數(shù)生長期BGC-823細胞，胰酶消化后接種至96孔細胞培養(yǎng)板，細胞密度為5×103個/孔，于培養(yǎng)24、48、72 h時分別加入10 μl/孔MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，分別加入150 μl/孔二甲基亞砜(DMSO)，置于恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，置于酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔在490 nm波長處光密度(OD)值即為細胞增殖活力，每組均設置3次生物學重復。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡 收集轉染48 h后各組BGC-823細胞，采用預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，加入結合緩沖液1 ml沖洗1次，放入離心機離心后棄上清，分別在各組細胞中加入結合緩沖液200 μl，混勻，加入5 μl碘化丙錠(PI)與5 μl Annexin V-FITC，室溫孵育20 min，分別加入結合緩沖液400 μl，置于流式細胞儀檢測各組BGC-823細胞凋亡率。

1.7熒光素酶報告基因檢測miR-299-5p靶基因 通過靶基因預測數(shù)據(jù)庫預測RRS1是miR-299-5p的靶基因，構建野生型與突變型基因靶點RRS1 3′UTR-熒光素酶表達載體(WT-3′URT、MUT-3′UTR)，分別取對數(shù)生長期BGC-823細胞接種至24孔細胞培養(yǎng)板，細胞密度調整為5×104個細胞/孔，細胞融合至60%左右時分別將空載體、WT-3′UTR、 MUT-3′UTR轉染至BGC-823細胞，同步轉染miR-299-5p mimic或miR-NC，統(tǒng)計熒光素酶與Renilla活性比值，嚴格按照熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進行操作。

1.8統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-299-5p和RRS1在胃癌BGC-823、MKN45、MGC803細胞和正常胃上皮細胞中的表達 qRT-PCR結果顯示，相較于正常胃上皮細胞GES-1，胃癌BGC-823、MKN45、MGC803細胞中miR-299-5p表達水平均顯著降低(P<0.05)，RRS1 mRNA表達顯著升高(P<0.05)。Western印跡檢測結果顯示，BGC-823、MKN45、MGC803細胞中RRS1蛋白表達水平顯著高于GES-1細胞(P<0.05)，見圖1，表1。BGC-823細胞中miR-299-5p表達水平最低，因此后續(xù)研究中將采用BGC-823細胞為主要研究細胞。

圖1 RRS1蛋白表達

表1 miR-299-5p和RRS1在胃癌BGC-823、MKN45、MGC803細胞和正常胃上皮細胞GES-1中的表達

2.2miR-299-5p過表達對胃癌BGC-823細胞增殖的影響 qRT-PCR檢測結果顯示，相較于miR-NC組，miR-299-5p組BGC-823細胞miR-299-5p表達水平顯著增高(P<0.05)。MTT法檢測結果顯示，轉染miR-299-5p mimic后，在48 h與72 h miR-299-5p組BGC-823細胞增殖活力顯著低于miR-NC組(P<0.05)，見表2。

表2 miR-299-5p過表達對胃癌BGC-823細胞增殖的影響

2.3miR-299-5p過表達對胃癌BGC-823細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測結果顯示，轉染miR-299-5p mimic的miR-299-5p組BGC-823細胞凋亡率〔(25.69±2.33)%〕顯著高于miR-NC組〔(8.13±0.82)%；t=12.313,P=0.000〕，見圖2。

圖2 細胞凋亡流式圖

2.4抑制RRS1表達對胃癌BGC-823細胞增殖和凋亡的影響 Western印跡檢測結果顯示，轉染si-RRS1后胃癌BGC-823細胞中RRS1蛋白表達水平顯著低于si-NC組(P<0.05)，見圖3。MTT與流式細胞術檢測結果顯示，與si-NC組相比，si-RRS1組BGC-823細胞增殖活力在48、72 h顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見表3。

圖3 轉染si-RRS1后胃癌BGC-823細胞中RRS1蛋白表達

表3 抑制RRS1表達對胃癌BGC-823細胞增殖和凋亡的影響

2.5miR-299-5p靶向調控RRS1的表達 熒光素酶報告基因檢測BGC-823細胞RRS1基因miR-299-5p定位序列結果顯示，miR-299-5p在RRS1基因3′UTR具有相應結合位點，見圖4。轉染WT-RRS1后，再轉染miR-299-5p mimic BGC-823細胞的熒光素酶活性(0.42±0.04)較再轉染miR-NC組(1.01±0.09)顯著降低(t=10.376，P=0.001)；轉染MUT-RRS1后，再轉染miR-299-5p mimic BGC-823細胞的熒光素酶活性(1.03±0.09)與miR-NC組(1.04±0.08)相比差異無統(tǒng)計學意義(t=0.144,P=0.893)。進一步采用Western印跡驗證miR-299-5p與RRS1基因的作用關系，結果顯示轉染miR-299-5p mimic后BGC-823細胞中RRS1蛋白表達水平(0.21±0.03)相較于miR-NC組(0.72±0.07)顯著降低(P<0.05)；轉染miR-299-5p抑制劑(anti-miR-299-5p)后BGC-823細胞中RRS1蛋白表達水平(1.05±0.09)顯著高于anti-miR-NC組(0.68±0.06，P<0.05)，見圖5。

1～4：miR-NC組,miR-299-5p組,anti-miR-NC組,anti-miR-299-5p組圖5 各組RRS1蛋白表達

2.6RRS1過表達逆轉了miR-299-5p過表達對胃癌BGC-823細胞增殖和凋亡的作用 共轉染miR-299-5p mimic與RRS1過表達質粒pcDNA-RRS1的miR-299-5p+pcDNA-RRS1組BGC-823細胞中RRS1蛋白表達水平較miR-299-5p+pcDNA組顯著升高(P<0.05)，見圖6。miR-299-5p+pcDNA-RRS1組BGC-823細胞增殖活力在48、72 h較miR-299-5p+pcDNA組顯著升高(P<0.05)；而miR-299-5p+pcD-NA-RRS1組BGC-823細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見表4。

1～4：miR-NC組,miR-299-5p組,miR-299-5p+pcDNA組,miR-299-5p+pcDNA-RRS1組圖6 共轉染miR-299-5p mimic后RRS1蛋白表達

表4 RRS1過表達逆轉了miR-299-5p過表達對胃癌BGC-823細胞增殖和凋亡的作用

3 討 論

胃癌發(fā)生過程涉及多種信號通路，挖掘胃癌表觀遺傳學變化成為探究發(fā)病機制的主要手段，編碼基因或非編碼基因異常變化均可促進胃癌發(fā)生發(fā)展〔7〕。miRNA作為內源性非編碼RNA，其可通過調控下游靶基因表達進而促進或抑制胃癌發(fā)生及發(fā)展〔8〕。miR-299-5p在頭頸部鱗狀細胞癌、胃腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中均呈低表達，并可作為評估癌癥進展及患者預后的重要分子標志物〔9～11〕。本研究結果說明miR-299-5p可能參與胃癌發(fā)生過程，提示miR-299-5p可能發(fā)揮抑癌基因作用。另有研究表明，miR-299-5p在肝細胞癌、膠質母細胞瘤中呈高表達，敲低miR-299-5p可有效抑制肝細胞癌及膠質母細胞瘤進展〔12,13〕。分析原因可能為不同腫瘤細胞或組織中miR-299-5p表達變化不同，這可能與腫瘤種類及惡性程度有關。本研究結果說明miR-299-5p過表達可有效抑制細胞增殖活力并提高細胞凋亡水平，提示miR-299-5p表達水平降低可能導致胃癌發(fā)生。

甲狀腺癌細胞中RRS1表達水平升高，采用RNA干擾技術沉默RRS1基因后甲狀腺癌細胞增殖率明顯降低〔14〕。乳腺癌細胞中RRS1呈高表達并可促進癌細胞增殖、遷移及侵襲〔15〕。與上述報道相似，本研究結果提示RRS1可能參與胃癌發(fā)生過程。沉默RRS1表達可能通過激活p53信號通路進而引起癌細胞周期阻滯并促使細胞凋亡〔16，17〕。通過慢病毒介導的RNAi敲低RRS1可抑制乳腺癌細胞、肝細胞癌細胞增殖并促進細胞凋亡〔18,19〕。本研究進一步采用RNA干擾技術降低RRS1表達，并分析其對胃癌BGC-823細胞增殖及凋亡的影響，結果顯示抑制RRS1表達后BGC-823細胞增殖活力明顯降低，細胞凋亡率顯著升高，與相關文獻報道相似〔20〕。說明抑制RRS1表達與miR-299-5p過表達對GES-1細胞增殖及凋亡的作用相同，miR-299-5p與RRS1可能存在負向調控作用。提示RRS1表達水平升高可通過促進胃癌細胞增殖、抑制其凋亡進而促進胃癌發(fā)生及發(fā)展。本研究結果顯示RRS1是miR-299-5p的靶基因，經Western印跡進一步驗證miR-299-5p可直接調控靶基因RRS1表達。進一步驗證miR-299-5p是否直接靶向RRS1發(fā)揮作用，結果發(fā)現(xiàn)miR-299-5p+pcDNA-RRS1組細胞增殖活力明顯高于miR-299-5p+pcDNA組，細胞凋亡率顯著降低，分析其可能作用機制為miR-299-5p表達水平升高可降低靶基因RRS1表達進而激活p53介導的信號通路導致胃癌細胞凋亡。提示miR-299-5p直接靶向調控RRS1表達進而抑制胃癌細胞增殖抑制并促進凋亡。