柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方氨基酸注射液中鹽酸半胱氨酸含量*

陳 娟，陳志永，孟 雪，崔小敏，任 慧，喬 園，陳瑞明

（陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710061）

復(fù)方氨基酸注射液適用于蛋白質(zhì)攝入不足、吸收障礙等氨基酸不能滿(mǎn)足機(jī)體代謝需要的患者，臨床應(yīng)用廣泛［1-3］。處方中多含少量鹽酸半胱氨酸，規(guī)格較小且共存氨基酸較多，常用柱前或柱后衍生氨基酸分析方法進(jìn)行測(cè)定。但鹽酸半胱氨酸的檢測(cè)靈敏度不夠強(qiáng)，其與共存氨基酸的分離度欠佳，無(wú)法對(duì)鹽酸半胱氨酸進(jìn)行準(zhǔn)確地定量測(cè)定。現(xiàn)行國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的鹽酸半胱氨酸測(cè)定方法均為用甲酸和過(guò)氧化氫氧化后，通過(guò)測(cè)定氧化產(chǎn)物的含量來(lái)計(jì)算含量，該方法專(zhuān)屬性差，測(cè)定的是氧化產(chǎn)物磺基丙氨酸，如原料中混入胱氨酸，或鹽酸半胱氨酸降解為胱氨酸，均會(huì)造成較大誤差［4-7］。張瑩等［8］采用異硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生法測(cè)定復(fù)方氨基酸注射液（3AA）中氨基酸含量，發(fā)現(xiàn)當(dāng)異硫氰酸苯酯乙腈溶液的質(zhì)量濃度較低時(shí)衍生物峰面積較小，質(zhì)量濃度較高又會(huì)產(chǎn)生其他衍生物。闞微娜等［9］用異硫氰酸苯酯與氨基衍生化后，測(cè)定了復(fù)方氨基酸注射液（9AA）中的鹽酸半胱氨酸含量，發(fā)現(xiàn)鹽酸半胱氨酸峰極易受到相鄰其他氨基酸峰的干擾，且不易重現(xiàn)。涂崇范等［10］采用氟苯柱前衍生測(cè)定半胱氨酸含量，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)且反應(yīng)溫度高。本研究中以2，4-二硝基氟苯（DNFB）為衍生化試劑，通過(guò)對(duì)試劑用量、試驗(yàn)反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行考察，優(yōu)化反應(yīng)條件。該方法反應(yīng)溫度低，反應(yīng)時(shí)間短，且簡(jiǎn)便易操作，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于復(fù)方氨基酸注射液（18AA-V）中鹽酸半胱氨酸含量的測(cè)定。現(xiàn)報(bào)道如下。

圖1 高效液相色譜圖

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；BS210S 型電子天平（精度為萬(wàn)分之一），BT25S 型電子天平（精度為十萬(wàn)分之一），均購(gòu)自北京賽多利斯天平有限公司；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸半胱氨酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為140699-201001）；復(fù)方氨基酸注射液（18AA-V，湖北一半天制藥有限公司，批號(hào)分別為20190219，20190311，20190332）；乙腈為色譜純，水為超純水，2，4-二硝基氟苯（DNFB）為生化試劑，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及衍生化反應(yīng)條件

色譜條件：色譜柱為KromasilC18柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.014 mol/L 磷酸氫二鉀溶液（pH=8.2，35 ∶65，V/ V）；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。

衍生化反應(yīng)條件：衍生化試劑-鹽酸半胱氨酸（80 ∶1，V/ V）；反應(yīng)溫度為60 ℃水浴；反應(yīng)時(shí)間為暗處反應(yīng)5 min。

2.2 溶液制備

衍生化試劑：稱(chēng)取2，4-二硝基氟苯（DNFB）適量，加入乙腈使溶解，終濃度為1%，即得。

對(duì)照品溶液：取鹽酸半胱氨酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加水溶解并制成質(zhì)量濃度為0.44 mg/mL 的溶液。精密量取0.5 mL，置10 mL 容量瓶，加入1% DNFB 乙腈溶液2 mL，再加入5 %碳酸氫鈉溶液1 mL，混勻。衍生化反應(yīng)在避光條件下進(jìn)行，于60 ℃水浴5 min，取出，室溫放置，用磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）稀釋至刻度，搖勻，即得［11］。

供試品溶液：精密吸取復(fù)方氨基酸注射液0.5 mL，按對(duì)照品溶液制備方法制備供試品溶液，即得。

空白溶液：精密吸取超純水0.5 mL，按對(duì)照品溶液制備方法制備空白溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：精密吸取空白溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀并分析。結(jié)果空白溶液不干擾鹽酸半胱氨酸的檢測(cè)，且鹽酸半胱氨酸峰與相鄰氨基酸峰達(dá)到有效分離。詳見(jiàn)圖1。

線性關(guān)系考察：取鹽酸半胱氨酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加水溶解，制成6.6，11.0，17.6，22.0，26.4，33.0 μg/mL 系列對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=68.955 X+1.085 6，r=0.999 7（n=6）。結(jié)果表明，鹽酸半胱氨酸進(jìn)樣量在0.132 0～0.660 0 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）考察：取對(duì)照品溶液并逐步稀釋?zhuān)磾M訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰響應(yīng)值。以LOD（S/ N ≥3）和LOQ（S/ N ≥10）為考察指標(biāo)，計(jì)算得鹽酸半胱氨酸的LOD 為0.101 4 ng，LOQ 為0.283 8 ng。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20190219），依法平行制備供試品溶液6 份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸半胱氨酸含量的RSD 為0.57%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一衍生化供試品溶液，室溫條件下分別于0，2，4，6，8 h 時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸半胱氨酸峰面積的RSD 為0.32%（n=5），表明供試品溶液在室溫條件下8 h 內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取鹽酸半胱氨酸對(duì)照品44 mg，精密稱(chēng)定，共6 份，分別置100 mL 容量瓶，加入樣品稀釋液至刻度，溶解，搖勻。取0.5 mL 置20 mL 容量瓶，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 樣品含量測(cè)定

取3 批樣品，依法制備衍生化供試品溶液。按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果3 批樣品（批號(hào)分別 為20190219，20190311，20190332）的 含 量 分 別 為91.10%，91.52%，90.68%。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)選擇

鹽酸半胱氨酸對(duì)照品溶液經(jīng)衍生化后，在220～500 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果顯示，在360 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇360 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相選擇及優(yōu)化

曾考察甲醇和乙腈，發(fā)現(xiàn)選用乙腈時(shí)峰形較好；同時(shí)，考察了醋酸鈉溶液、磷酸氫二鈉溶液和磷酸氫二鉀溶液，發(fā)現(xiàn)選用磷酸氫二鉀溶液時(shí)峰形較好。通過(guò)調(diào)整乙腈和磷酸氫二鉀溶液比例，最終確定體積比為35 ∶65，鹽酸半胱氨酸出峰時(shí)間約為17 min，與其他干擾峰達(dá)到良好分離。

3.3 衍生化反應(yīng)條件選擇

衍生試劑加入量考察：精密吸取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液6 份，以加入不同量（8，16，40，80，160，320 倍）的衍生化試劑考察，并進(jìn)行液相分析，進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果表明，當(dāng)衍生化試劑與鹽酸半胱氨酸體積比大于40 ∶1時(shí)，樣品中衍生化產(chǎn)物的峰面積無(wú)變化，故本試驗(yàn)中選擇體積比為80 ∶1。

衍生化反應(yīng)時(shí)間考察：精密吸取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液5 份，以不同反應(yīng)時(shí)間（5，10，15，20，30 min）進(jìn)行考察，制備樣品進(jìn)行液相分析，進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果表明，衍生化反應(yīng)時(shí)間超過(guò)5 min，衍生化產(chǎn)物的峰面積無(wú)明顯變化。故本試驗(yàn)中優(yōu)選的反應(yīng)時(shí)間為5 min。

衍生化反應(yīng)溫度考察：精密吸取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液5 份，以不同反應(yīng)溫度（室溫，40，60，80 ℃）進(jìn)行考察，并進(jìn)行液相分析，進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果表明，當(dāng)反應(yīng)溫度高于60℃時(shí)，樣品衍生化產(chǎn)物的峰面積無(wú)變化，故優(yōu)選的反應(yīng)溫度為60 ℃。

氨基酸含量的測(cè)定通常選用柱前衍生法。本試驗(yàn)中分別從衍生化試劑的加入量、試驗(yàn)的反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行考察，得到優(yōu)選條件：衍生化試劑-鹽酸半胱氨酸（80 ∶1，V/ V），反應(yīng)溫度為60 ℃水浴，于暗處反應(yīng)5 min。徐崇范等［10］選用80 ℃水浴中加熱30 min 測(cè)定依達(dá)拉奉注射液中鹽酸半胱氨酸含量；徐偉娜等［11］選用60 ℃水浴暗處反應(yīng)20 min 進(jìn)行乙酰氨基酚注射液中鹽酸半胱氨酸的測(cè)定。本研究中的衍生化反應(yīng)條件與其相比，反應(yīng)溫度低，且反應(yīng)時(shí)間短，節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的測(cè)定復(fù)方氨基酸注射液中鹽酸半胱氨酸含量的方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確穩(wěn)定，重復(fù)性好，可用于復(fù)方氨基酸注射液的質(zhì)量控制。